Mikroinjekce-technika genetického inženýrství

author
7 minutes, 13 seconds Read

mikroinjekce

mikroinjekce je technika doručování cizí DNA do živé buňky (buňky, vajíčka, oocytů, embryí zvířat) skleněnou mikropipetou. Jeden konec skleněné mikropipety se zahřívá, dokud se sklo poněkud zkapalní. Rychle se protáhne, což na zahřátém konci vytváří velmi jemný hrot. Špička pipety dosahuje průměru asi 0,5 mm, který připomíná injekční jehlu. Proces dodávání cizí DNA se provádí pod silným mikroskopem. Buňky, které mají být mikroinjekovány, se umístí do nádoby (obr. 4.15). Do zorného pole mikroskopu je umístěna přidržovací pipeta. Přidržovací pipeta drží cílovou buňku na špičce, když je jemně nasávána. Špička mikropipety se vstřikuje přes membránu buňky. Obsah jehly je dodáván do cytoplazmy a prázdná jehla je vyjmuta.

a method of microinjection of DNA preparation in egg

Fig. 4.15. Metoda mikroinjekce přípravy DNA ve vejci.

Xenopus oocyty byly široce používány pro studium transkripce mikroinjekcí, protože oocyty obsahují mezi 6 000 a 100 000 nebo více molekul RNA polymerázy než somatické buňky. Mikroinjekce je technicky snadná kvůli velké velikosti oocytů. Byly charakterizovány některé endogenní vzorce genové regulace během vývoje (Wickens and Laskey, 1981). Injikovaná DNA se náhodně integruje s jadernou DNA a její exprese by mohla být možná pouze tehdy, když je cizí DNA připojena k vhodné promotorové sekvenci. Existuje mnoho příkladů, kdy byly mikroinjektovány a úspěšně přeneseny různé typy živočišných buněk.
Rubin a Spradling (1982) poprvé zavedli Gen Drosophila pro xanthindehydrogenázu do P-prvku (rodičovského prvku), který byl mikroinjekován intaktním pomocným P-prvkem do embrya s nedostatkem tohoto genu. Taková embrya později vyvinula mouchy s růžově zbarvenými očima než mozaikovými očima jako v první rodičovské generaci.
produkce transgenních zvířat
v roce 1982, R. D. Palmiter z Washingtonské univerzity A R. L.Brinter z Pennsylvanian University izoloval Gen králičího růstového hormonu (P-globin), Gen lidského růstového hormonu (i-globin) a Gen thymidinkinázy a je spojen odděleně s promotorovou oblastí myši spojenou s genem metalothionein I (gen, který kóduje protein vázající kov). Toto bylo připojeno k plazmidu pBR322 za vzniku rekombinantních plazmidů. Zralá vejce z dospělé myši byla získána chirurgicky a oplodněna spermiemi in vitro. Ihned byla oplodněná vajíčka mikroinjektována rekombinantními plazmidy před fúzí spermií a jader vajíček za vzniku diploidní zygoty. Plazmidy se obecně kombinují homologně ve vajíčku a vytvářejí dlouhý opakovaný konkatemer, který se pak náhodně integruje a dává opakované geny na jednom chromozomálním místě. Upravená embrya byla poté implantována do dělohy hostitelské myší matky pro další vývoj. Výsledné myši se nazývají „transgenní myši“, protože část genomu pochází z jiného geneticky nesouvisejícího organismu. Vzhledem k zavedení cizího genu před jadernou fúzí, chromozomální integrace probíhá brzy a potomstvo obsahuje nové geny. Velikost a tělesná hmotnost potomků byla extrémně větší než normální (obr. 4.16).

v jiném experimentu ( Palmiter et al 1982) injikoval myším embryím fragment DNA obsahující Gen růstového hormonu potkana fúzovaný s promotorovou oblastí genu myšího metallothioneinu I. V tomto experimentu byly použity spíše lineární fragmenty DNA než plazmidy, protože se efektivněji integrují do myších chromozomů. V důsledku toho bylo vyrobeno 21 myší, z nichž sedm obsahovalo fúzní gen. Šest bylo dvakrát větší tělesné hmotnosti než ostatní. Úroveň růstových hormonů se mnohonásobně zvýšila (mezi 200-800 krát) více než kontrola. Kromě toho byla hladina růstového hormonu mRNA také zvýšena v jaterních buňkách. Podobně mnoho transgenních zvířat, jako jsou ovce, kozy,prasata, králík atd. byly také vyrobeny technikou mikroinjekce.
technologie in vitro fertilizace (IVF)
termín in vitro znamená ve skle nebo v umělém stavu a IVF označuje skutečnost, že oplodnění vajíčka spermatem se vyskytuje ve skle.

produkce transgenních myší; MT, methionin

Obr. 4.16. Produkce transgenních myší; MT, methionin.

technologie IVF u hospodářských zvířat
v současné době byly exogenní hormony vyvinuty pomocí technologie přirozené a rekombinantní DNA, která se používá k indukci superovulace u hospodářských zvířat. Superovulace je fenomén produkce vyšší než normální počet vajíček hormonální léčbou jedinou ženou najednou.
normální kráva produkuje jedno nebo dvě vejce během ovulačního období, zatímco stejná může produkovat 8-10 vajec, když je vystavena superovulaci. Proto při normální reprodukci zvíře produkuje asi 4-5 potomků ve svém životě, zatímco pomocí technologie IVF může ve svém životě produkovat 50-80 potomků. Podrobný popis viz manipulace s reprodukcí a transgenními zvířaty.
IVF technologie u lidí
IVF technologie byla průkopníkem u lidí Prof. Robert Winston. Stejnou techniku použili P. Steptoe a R. Edwards k výrobě první zkumavky na světě, Louise J. Brown, 25. července 1978. Od té doby bylo dosud vyrobeno více než 25 000 dětí.
dřívější vejce byla získána z vaječníku pacienta pomocí laparoskopu. Malý řez se provádí těsně pod pupkem a zavede se laparoskop. Vejce jsou odstraněna dutou jehlou. Obecně lze po určité době přirozeným způsobem získat pouze jedno vejce. Ale díky superovulaci lze získat více vajec najednou.
hormon se injektuje denně po dobu asi 28 dnů. Někdy se mohou objevit vedlejší účinky. Vejce jsou uchovávána ve speciální tekutině a mikroskopicky vyšetřena na případné vady. Vejce se přenesou do Petriho misky obsahující čerstvé sperma. Oplodnění gamet trvá 12-15 hodin. Po oplodnění se zygota udržuje v jiné tekutině při tělesné teplotě. Dělení buněk je pravidelně pozorováno. Když embryo dosáhne fáze blastocysty, poslední fáze růstu, je implantován do dělohy. Není nutné, aby všechny implantované embrya rostly. Po implantaci s ním souvisí mnoho komplikací. Proto, aby se dosáhlo úspěchu, jsou obecně tři embrya přenesena do dělohy najednou. To má za následek narození jednoho, dvou nebo tří dětí na základě úspěchu. Tento proces se nazývá zygote intrafallopian transfer (ZIFT). Existuje další technika, kdy jsou vajíčka a spermie umístěny do vejcovodu, aby se usnadnilo oplodnění. Toto je známé jako gamete intrafallopian transfer (dárek).
v Indii existuje devět center, jako je Bombaj, Kolata, Chenai, Dillí a další, které pomáhají bezdětným párům.
kromě ZIFT a GIFT se mikroinjekční technika používá také u oligospermických pacientů. Zde se jedna spermie přímo vstříkne do vajíčka, aby se usnadnilo oplodnění.
problémy související s dětmi ze zkumavky
ačkoli technologie IVF je přínosem pro bezdětné páry, přesto s ní existuje několik problémů, pokud se stane komercializovanou. Tyto problémy mohou být náboženské, etické, emocionální nebo politické. Například Katolická církev neschvaluje techniku IVF, protože prohlašuje, že koncepce by nikdy neměla být vyjmuta z těla. Dar je přijatelný, zatímco ZIFT není. Muslimské země jako Malajsie považují darování spermií za nemorální. Děti narozené darovanými spermiemi jsou považovány za nelegitimní. V Indii však zatím není žádná kontroverze. V Indii byla v lednu 1994 zřízena první spermabanka v Novém Dillí, aby pomohla bezdětným párům.
jedním z emocionálních problémů jsou nevyužitá extra embrya. Ať už budou vyhozeny nebo implantovány náhradním matkám. První z nich je morální otázka. Náhradní matky působí jako inkubátor zvířat a porodí dítě po normálním těhotenství. Nepřispívají genetickými materiály, protože pocházejí od dárců. Náhradní matky by proto mohly být komercializovány. Dítě nebude jejich skutečné. Budou děti přenášené darovaným vajíčkem / spermatem společensky nebo nábožensky uznány? Budou děti známy o svých biologických rodičích? Přijmou je jejich rodiče?

Similar Posts

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.