Mikroinjektion – Gentechnische Technik

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Mikroinjektion

Mikroinjektion ist eine Technik zur Abgabe von Fremd-DNA in eine lebende Zelle (eine Zelle, ein Ei, eine Eizelle, Embryonen von Tieren) durch eine Glasmikropipette. Ein Ende einer Glasmikropipette wird erhitzt, bis sich das Glas etwas verflüssigt. Es wird schnell gedehnt, was am erhitzten Ende eine sehr feine Spitze bildet. Die Spitze der Pipette erreicht einen Durchmesser von etwa 0,5 mm, der einer Injektionsnadel ähnelt. Der Prozess der Abgabe von Fremd-DNA erfolgt unter einem leistungsstarken Mikroskop. Die zu mikroinjektierenden Zellen werden in einen Behälter (Fig. 4.15). Eine Haltepipette wird in das Sichtfeld des Mikroskops gelegt. Die Haltepipette hält eine Zielzelle an der Spitze, wenn sie sanft angesaugt wird. Die Spitze der Mikropipette wird durch die Membran der Zelle injiziert. Der Inhalt der Nadel wird in das Zytoplasma abgegeben und die leere Nadel wird herausgenommen.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von DNA-Präparation in Ei

Abb. 4.15. Eine Methode der Mikroinjektion von DNA-Präparation in Ei.

Xenopus-Oozyten wurden häufig für die Untersuchung der Transkription durch Mikroinjektion verwendet, da Oozyten zwischen 6.000 und 100.000 oder mehr RNA-Polymerase-Moleküle enthalten als somatische Zellen. Die Mikroinjektion ist aufgrund der Größe der Eizellen technisch einfach. Ein Teil des endogenen Musters der Genregulation während der Entwicklung wurde charakterisiert (Wickens und Laskey, 1981). Die injizierte DNA integriert sich zufällig mit der Kern-DNA und ihre Expression könnte nur möglich sein, wenn die fremde DNA an eine geeignete Promotorsequenz gebunden ist. Es gibt viele Beispiele, in denen verschiedene Arten von tierischen Zellen mikroinjiziert und erfolgreich übertragen wurden.
Rubin und Spradling (1982) führten zum ersten Mal ein Drosophila-Gen für Xanthindehydrogenase in ein P-Element (Elternelement) ein, das mit einem intakten Helfer-P-Element in einen Embryo injiziert wurde, der für dieses Gen defizient war. Solche Embryonen entwickelten später Fliegen mit rosigen Augen als Mosaikaugen wie in der ersten Elterngeneration.
Produktion transgener Tiere
1982 haben R.D. Palmiter von der Washington University und R.L.Brinter von der Pennsylvanian University isolierte das Kaninchen-Wachstumshormon (p-Globin) -Gen, das menschliche Wachstumshormon ((i-Globin) -Gen sowie das Thymidinkinase-Gen und verknüpfte es separat mit der Promotorregion der Maus, die mit dem Metallothionein I-Gen assoziiert ist (ein Gen, das für ein Metallbindungsprotein kodiert). Dieses wurde mit Plasmid pBR322 verbunden, um die recombinant Plasmide zu produzieren. Reife Eier von erwachsenen Mäusen wurden chirurgisch gewonnen und in vitro mit Spermien befruchtet. Sofort wurden die befruchteten Eizellen mit rekombinanten Plasmiden mikroinjiziert, bevor die Spermien- und Eierkerne zu einer diploiden Zygote verschmolzen sind. Die Plasmide verbinden sich im Allgemeinen homolog miteinander innerhalb des Eies und bilden einen langen wiederholten Konkatemer, der sich dann zufällig integriert, um wiederholte Gene an einer einzelnen chromosomalen Stelle zu ergeben. Die manipulierten Embryonen wurden dann zur weiteren Entwicklung in die Gebärmutter einer Wirtsmausmutter implantiert. Die resultierenden Mäuse werden als transgene Mäuse bezeichnet, da ein Teil des Genoms von einem anderen genetisch nicht verwandten Organismus stammt. Durch die Einführung fremder Gene vor der Kernfusion findet die chromosomale Integration früh statt und die Nachkommen enthalten neue Gene. Größe und Körpergewicht der Nachkommen waren extrem größer als die normalen (Abb. 4.16).

In einem anderen Experiment (Palmiter et al 1982) injizierten Mausembryonen ein DNA-Fragment, das das Ratten-Wachstumshormon-Gen enthielt, das mit der Promotorregion des Maus-Metallothionein-I-Gens fusioniert war. In diesem Experiment wurden lineare DNA-Fragmente anstelle von Plasmiden verwendet, da diese sich effizienter in die Mauschromosomen integrieren. Folglich wurden 21 Mäuse produziert, von denen sieben das Fusionsgen enthielten. Sechs waren zwei Mal größer im Körpergewicht als die anderen. Das Niveau der Wachstumshormone stieg um ein Vielfaches (zwischen 200-800 mal) mehr als die Kontrolle. Darüber hinaus war der Spiegel an Wachstumshormon-mRNA auch in Leberzellen erhöht. Ebenso viele transgene Tiere wie Schafe, Ziegen, Schweine, Kaninchen usw. wurden auch durch Mikroinjektionstechnik hergestellt.
In-vitro-Fertilisation (IVF) -Technologie
Der Begriff in vitro bedeutet in Glas oder in künstlichem Zustand, und IVF bezieht sich auf die Tatsache, dass die Befruchtung der Eizelle durch Spermien in Glaswaren erfolgt.

Produktion transgener Mäuse; MT, Methionin

Abb. 4.16. Produktion von transgenen Mäusen; MT, Methionin.

IVF-Technologie bei Nutztieren
Heutzutage wurden exogene Hormone durch natürliche und rekombinante DNA-Technologie entwickelt, die zur Induktion der Superovulation bei Nutztieren verwendet werden. Superovulation ist ein Phänomen, bei dem durch hormonelle Behandlung jeweils eine Frau mehr als die normale Anzahl von Eiern produziert.
Eine normale Kuh produziert während einer Ovulationsperiode ein oder zwei Eier, während dieselbe bei Superovulation 8-10 Eier produzieren kann. Daher produziert ein Tier durch normale Fortpflanzung etwa 4-5 Nachkommen in seinem Leben, während es durch IVF-Technologie 50-80 Nachkommen in seinem Leben produzieren kann. Für eine detaillierte Beschreibung siehe Manipulation der Fortpflanzung und transgene Tiere.
IVF-Technologie beim Menschen
Die IVF-Technologie wurde von Prof. Robert Winston beim Menschen entwickelt. Die gleiche Technik wurde von P.Steptoe und R. Edwards verwendet, um das weltweit erste weibliche Reagenzglasbaby, Louise J. Brown, am 25. Juli 1978 zu produzieren. Seitdem wurden mehr als 25.000 Babys produziert.
Frühere Eizellen wurden mittels Laparoskopie aus dem Eierstock der Patientin gewonnen. Ein kleiner Einschnitt wird direkt unter dem Nabel gemacht und das Laparoskop eingeführt. Eier werden mit einer Hohlnadel entfernt. Im Allgemeinen kann nach einer bestimmten Zeit auf natürliche Weise jeweils nur ein einziges Ei beschafft werden. Aber durch Superovulation können mehr Eier gleichzeitig erhalten werden.

Das Hormon wird etwa 28 Tage lang täglich injiziert. Manchmal können Nebenwirkungen auftreten. Die Eier werden in einer speziellen Flüssigkeit aufbewahrt und mikroskopisch auf Defekte untersucht. Die Eier werden in eine Petrischale mit frischem Samen überführt. Die Befruchtung der Gameten dauert 12-15 Stunden. Nach der Befruchtung Zygote wird in einer anderen Flüssigkeit bei der Körpertemperatur gehalten. Die Zellteilung wird regelmäßig beobachtet. Wenn der Embryo das Blastozystenstadium, das letzte Wachstumsstadium, erreicht, wird er in die Gebärmutter implantiert. Es ist nicht notwendig, dass alle implantierten Embryonen wachsen. Es gibt viele Komplikationen nach der Implantation. Um Erfolg zu haben, werden daher im Allgemeinen drei Embryonen gleichzeitig in die Gebärmutter übertragen. Dies führt zur Geburt eines, zwei oder drei Babys basierend auf dem Erfolg. Dieser Vorgang wird als Zygote intrafallopian Transfer (ZIFT) bezeichnet. Es gibt eine andere Technik, bei der Eier und Spermien in Eileiter gelegt werden, um die Befruchtung zu erleichtern. Dies wird als gametenintrafallopischer Transfer (GIFT) bezeichnet.
In Indien gibt es neun Zentren wie Mumbai, Kolata, Chenai, Delhi und andere, die kinderlosen Paaren helfen.
Neben ZIFT und GIFT wird die Mikroinjektionstechnik auch bei oligospermischen Patienten angewendet. Hier wird ein Sperma direkt in eine Eizelle injiziert, um die Befruchtung zu erleichtern.
Probleme im Zusammenhang mit Reagenzglasbabys
Obwohl die IVF-Technologie ein Segen für kinderlose Paare ist, gibt es mehrere damit verbundene Probleme, wenn sie kommerzialisiert wird. Diese Probleme können religiös, ethisch, emotional oder politisch sein. Zum Beispiel genehmigt die katholische Kirche die IVF-Technik nicht, da sie verkündet, dass die Empfängnis niemals aus dem Körper genommen werden sollte. Das GESCHENK ist akzeptabel, während ZIFT nicht. Muslimische Länder wie Malaysia halten die Samenspende für unmoralisch. Kinder, die von gespendeten Spermien geboren werden, gelten als illegitim. In Indien gibt es jedoch bisher keine Kontroverse. In Indien wurde im Januar 1994 in Neu-Delhi die erste Samenbank eingerichtet, um kinderlosen Paaren zu helfen.
Eines der emotionalen Probleme sind die ungenutzten zusätzlichen Embryonen. Ob sie weggeworfen oder in Leihmütter implantiert werden. Die erste ist die moralische Frage. Die Leihmütter fungieren als Tierbrutkasten und bringen das Baby nach der normalen Schwangerschaft zur Welt. Sie tragen nicht das genetische Material bei, wie es von den Spendern kommt. Daher könnten die Leihmütter kommerzialisiert werden. Das Kind wird nicht ihr wahres sein. Werden die Kinder, die durch gespendete Eizellen / Spermien geboren werden, sozial oder religiös anerkannt? Werden die Kinder von ihren leiblichen Eltern erfahren? Werden ihre Eltern sie akzeptieren?

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