Microinyección – Técnica de Ingeniería Genética

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Microinyección

La microinyección es una técnica de entrega de ADN extraño a una célula viva (una célula, un huevo, un ovocito, embriones de animales) a través de una micropipeta de vidrio. Un extremo de una micropipeta de vidrio se calienta hasta que el vidrio se licúa un poco. Se estira rápidamente, lo que forma una punta muy fina en el extremo calentado. La punta de la pipeta alcanza aproximadamente 0,5 mm de diámetro, lo que se asemeja a una aguja de inyección. El proceso de entrega de ADN extraño se realiza bajo un microscopio de gran alcance. Las células a microinyectar se colocan en un recipiente (Fig. 4.15). Se coloca una pipeta de sujeción en el campo de visión del microscopio. La pipeta de sujeción sostiene una célula objetivo en la punta cuando se aspira suavemente. La punta de la micropipeta se inyecta a través de la membrana de la célula. El contenido de la aguja se introduce en el citoplasma y se extrae la aguja vacía.

 Un método de microinyección de preparación de ADN en huevo

Fig. 4.15. Método de microinyección de la preparación de ADN en huevo.

Los ovocitos de Xenopus se han utilizado ampliamente para el estudio de la transcripción por microinyección porque los ovocitos contienen entre 6.000 y 100.000 o más moléculas de ARN polimerasa que las células somáticas. La microinyección es técnicamente fácil debido al gran tamaño de los ovocitos. Se ha caracterizado parte del patrón endógeno de regulación génica durante el desarrollo (Wickens y Laskey, 1981). El ADN inyectado se integra aleatoriamente con el ADN nuclear y su expresión solo podría ser posible cuando el ADN extraño se une a una secuencia promotora adecuada. Hay muchos ejemplos en los que diferentes tipos de células animales han sido microinyectadas y transferidas con éxito.
Rubin y Spradling (1982) introdujeron por primera vez el gen Drosophila para la xantina deshidrogenasa en un elemento P (elemento parental) que fue microinyectado con un elemento P auxiliar intacto en el embrión deficiente para este gen. Estos embriones más tarde desarrollaron moscas con ojos de color rosado que ojos de mosaico, como en la primera generación parental.
Producción de Animales Transgénicos
En 1982, R. D. Palmiter de la Universidad de Washington y R. L.Brinter de la Universidad de Pensilvania aisló el gen de la hormona de crecimiento del conejo (p-globina), el gen de la hormona de crecimiento humano (i-globina) y el gen de la timidina quinasa y se vinculó por separado a la región promotora del ratón asociada con el gen de la metalotioneína I(un gen que codifica una proteína de unión a metales). Esto se unió al plásmido pBR322 para producir los plásmidos recombinantes. Los óvulos maduros de ratón adulto se recuperaron quirúrgicamente y se fertilizaron con espermatozoides in vitro. Inmediatamente, los óvulos fertilizados fueron microinyectados con plásmidos recombinantes antes de que los núcleos de espermatozoides y óvulos se fusionaran para formar un cigoto diploide. Los plásmidos generalmente se combinan de forma homóloga entre sí dentro del óvulo formando un concatemero de larga repetición que luego se integra aleatoriamente para dar genes repetidos en un solo sitio cromosómico. Los embriones de ingeniería se implantaron en el útero de una madre de ratón huésped para su posterior desarrollo. Los ratones resultantes se denominan «ratones transgénicos», ya que parte del genoma proviene de otro organismo genéticamente no relacionado. Debido a la introducción de genes extraños antes de la fusión nuclear, la integración cromosómica tiene lugar temprano y la progenie contiene nuevos genes. El tamaño y el peso corporal de las progenies eran extremadamente mayores que los normales (Fig. 4.16).

En otro experimento ( Palmiter et al 1982) se inyectaron embriones de ratón con un fragmento de ADN que contenía el gen de la hormona de crecimiento de rata fusionado a la región promotora del gen de metalotioneína I de ratón. En este experimento, se utilizaron fragmentos de ADN lineales en lugar de plásmidos porque se integran de manera más eficiente en los cromosomas de ratón. En consecuencia, se produjeron 21 ratones, de los cuales siete contenían el gen de fusión. Seis eran dos veces más grandes en peso corporal que los otros. El nivel de hormonas de crecimiento aumentó muchas veces (entre 200 y 800 veces) más que el nivel de control. Además, el nivel de ARNm de hormona de crecimiento también aumentó en las células hepáticas. Del mismo modo, muchos animales transgénicos como ovejas, cabras, cerdos, conejos, etc. también se han producido a través de la técnica de microinyección.
Tecnología de fertilización in vitro (FIV)
El término in vitro significa en vidrio o en condición artificial, y la FIV se refiere al hecho de que la fertilización de óvulos por espermatozoides ocurre en cristalería.

 Producción de ratones transgénicos; MT, metionina

Fig. 4.16. Producción de ratones transgénicos; MT, metionina.

Tecnología de FIV en animales de granja
Hoy en día, las hormonas exógenas se han desarrollado a través de tecnología de ADN natural y recombinante que se utilizan para inducir la superovulación en animales de granja. La superovulación es un fenómeno de producción de óvulos mayores que el número normal a través del tratamiento hormonal por una sola hembra a la vez.
Una vaca normal produce uno o dos huevos durante un período ovulatorio, mientras que la misma puede producir de 8 a 10 huevos cuando se somete a superovulación. Por lo tanto, a través de la reproducción normal, un animal produce alrededor de 4-5 crías en su vida, mientras que a través de la tecnología de fecundación in vitro, el mismo puede producir 50-80 crías en su vida. Para una descripción detallada, véase Manipulación de la Reproducción y Animales Transgénicos.
Tecnología de FIV en humanos
La tecnología de FIV fue pionera en humanos por el Prof. Robert Winston. La misma técnica fue utilizada por P. Steptoe y R. Edwards para producir el primer bebé de tubo de ensayo del mundo, Louise J. Brown, el 25 de julio de 1978. Desde entonces, hasta la fecha se han producido más de 25.000 bebés.
Se recuperaron óvulos anteriores del ovario de la paciente mediante laparoscopio. Se hace una pequeña incisión justo debajo del ombligo y se introduce el laparoscopio. Los huevos se extraen con una aguja hueca. En general, solo se puede obtener un solo huevo a la vez después de cierto período de forma natural. Pero a través de la superovulación se pueden obtener más huevos a la vez.

La hormona se inyecta diariamente durante aproximadamente 28 días. A veces se pueden producir efectos secundarios. Los óvulos se mantienen en un líquido especial y se examinan microscópicamente para detectar cualquier defecto. Los huevos se transfieren a una placa de Petri que contiene semen fresco. Los gametos tardan de 12 a 15 horas en fertilizarse. Después de la fertilización, el cigoto se mantiene en otro líquido a la temperatura corporal. La división celular se observa regularmente. Cuando el embrión llega a la etapa de blastocisto, la última etapa de crecimiento, se implanta en el útero. No es necesario que todos los embriones implantados crezcan. Hay muchas complicaciones relacionadas con él después de la implantación. Por lo tanto, para tener éxito, generalmente se transfieren tres embriones al útero a la vez. Esto resulta en el nacimiento de uno, dos o tres bebés en función del éxito. Este proceso se llama transferencia intrafalopiana de cigotos (ZIFT). Hay otra técnica en la que se colocan óvulos y espermatozoides en las trompas de falopio para facilitar la fertilización. Esto se conoce como la transferencia intratubárica de gametos (GIFT).
En la India, hay nueve centros como Mumbai, Kolata, Chenai, Delhi y otros que ayudan a las parejas sin hijos.
Además de ZIFT y GIFT, la técnica de microinyección también se aplica en pacientes oligospermicos. Aquí, un espermatozoide se inyecta directamente en un óvulo para facilitar la fertilización.
Problemas relacionados con los bebés de tubo de ensayo
Aunque la tecnología de FIV es una bendición para las parejas sin hijos, sin embargo, hay varios problemas relacionados con ella, si se comercializa. Estos problemas pueden ser religiosos, éticos, emocionales o políticos. Por ejemplo, la Iglesia Católica no aprueba la FIV técnica como proclama que la concepción nunca debe ser tomado fuera del cuerpo. El REGALO es aceptable, mientras que ZIFT no lo es. Países musulmanes como Malasia creen que la donación de esperma es inmoral. Los hijos nacidos de espermatozoides donados se consideran ilegítimos. Sin embargo, no hay controversia en la India hasta el momento. En enero de 1994 se estableció en Nueva Delhi el primer banco de esperma de la India para ayudar a las parejas sin hijos.
Uno de los problemas emocionales son los embriones adicionales no utilizados. Si se desecharán o se implantarán en madres de alquiler. La primera es la cuestión moral. Las madres de alquiler actúan como incubadoras de animales y dan a luz al bebé después de la gestación normal. No aportan los materiales genéticos, ya que provienen de los donantes. Por lo tanto, las madres sustitutas podrían ser comercializadas. El niño no será el verdadero. ¿Se otorgará reconocimiento social o religioso a los niños nacidos a través de óvulos/espermatozoides donados? ¿Se conocerá a los niños de sus padres biológicos? ¿Los aceptarán sus padres?

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