Mikroinjektio-geenitekniikan tekniikka

author
5 minutes, 13 seconds Read

mikroinjektio

mikroinjektio on tekniikka, jossa vieras DNA toimitetaan elävään soluun (solu, munasolu, munasolu, eläinten alkiot) lasisen mikropipetin kautta. Lasisen mikropipetin toista päätä kuumennetaan, kunnes lasi hieman nesteytyy. Se venyy nopeasti, mikä muodostaa erittäin hienon kärjen kuumennettuun päähän. Pipetin kärki on halkaisijaltaan noin 0, 5 mm, mikä muistuttaa injektioneulaa. Vierasta DNA: ta tuotetaan voimakkaalla mikroskoopilla. Mikroinjektoitavat solut asetetaan astiaan (Kuva. 4.15). Mikroskoopin näkökenttään asetetaan pitopipetti. Pitopipetin kärjessä on kohdesolu, kun sitä imetään varovasti. Mikropipetin kärki ruiskutetaan solun kalvon läpi. Neulan sisältö kulkeutuu sytoplasmaan ja tyhjä neula otetaan ulos.

a method of MICROINJECTION of DNA preparation in egg

Fig. 4.15. Menetelmä DNA-valmisteen mikroinjektioksi munassa.

ksenopus-varhaismunasoluja on käytetty laajalti mikroinjektiolla tapahtuvan transkription tutkimiseen, koska varhaismunasoluissa on vähintään 6 000-100 000 RNA-polymeraasimolekyyliä kuin somaattisissa soluissa. Mikroinjektio on teknisesti helppoa varhaismunasolujen suuren koon vuoksi. Joitakin geenien endogeenisiä säätelykuvioita kehityksen aikana on luonnehdittu (Wickens and Laskey, 1981). Ruiskutettu DNA integroituu satunnaisesti ydin-DNA: han ja sen ilmentyminen voi olla mahdollista vain, kun vieras-DNA on kiinnittynyt sopivaan promoottorijaksoon. On monia esimerkkejä, joissa erilaisia eläinsoluja on mikroinjektoitu ja siirretty onnistuneesti.
Rubin and Spradling (1982) toi ensimmäistä kertaa ksantiinidehydrogenaasin Drosophila-geenin P-elementtiin (parental element), joka mikroinjektoitiin ehjällä auttaja-P-elementillä tämän geenin puutteelliseksi alkioksi. Tällaiset alkiot kehittivät myöhemmin kärpäsiä, joilla oli ruusunväriset silmät kuin mosaiikkisilmillä, kuten ensimmäisellä vanhempien sukupolvella.
siirtogeenisten eläinten tuotanto
vuonna 1982, R. D. Palmiter Washingtonin yliopistosta ja R. L.Brinter Pennsylvanian yliopistosta eristi kanin kasvuhormonin (p-globiini) geenin, ihmisen kasvuhormonin ((i-globiini) geenin sekä tymidiinikinaasigeenin ja liittyy erikseen hiiren promoottorialueeseen, joka liittyy metallotioneiini I-geeniin (geeni, joka koodaa metallia sitovaa proteiinia). Tämä yhdistettiin pbr322 plasmidiin rekombinanttien plasmidien tuottamiseksi. Aikuisen hiiren kypsät munasolut otettiin talteen kirurgisesti ja hedelmöitettiin siittiöillä in vitro. Hedelmöityneet munasolut mikroinjektoitiin heti rekombinanttiplasmideilla ennen kuin siittiön ja munasolun tumat ovat fuusioituneet diploidiseksi tsygootiksi. Plasmidit yhdistyvät yleensä homologisesti toisiinsa munasolun sisällä muodostaen pitkän toistuvan aivotärähdyksen, joka sitten integroituu satunnaisesti antaen toistuvia geenejä yhteen kromosomipaikkaan. Muunnellut alkiot istutettiin sitten isäntähiiriemon kohtuun jatkokehitystä varten. Tuloksena olevia hiiriä kutsutaan ”siirtogeenisiksi hiiriksi”, koska osa perimästä on peräisin toisesta geneettisesti toisistaan riippumattomasta organismista. Johtuen vieraan geenin käyttöönotosta ennen ydinfuusiota kromosomien integraatio tapahtuu varhain ja jälkeläiset sisältävät uusia geenejä. Sukujen koko ja paino olivat erittäin suurempia kuin normaalit (Kuva. 4.16).

toisessa kokeessa ( Palmiter et al 1982) ruiskutettiin hiiren alkioita rotan kasvuhormonigeenin sisältävällä DNA-fragmentilla, joka fuusioitui hiiren metallotioneiini I-geenin promoottorialueeseen. Tässä kokeessa käytettiin lineaarisia DNA-fragmentteja plasmidien sijaan, koska nämä integroituvat tehokkaammin hiiren kromosomeihin. Näin ollen hiiriä syntyi 21, joista seitsemän sisälsi fuusiogeenin. Kuusi oli kaksi kertaa muita suurempia ruumiinpainoltaan. Kasvuhormonien taso nousi moninkertaiseksi (välillä 200-800 kertaa) kontrollia enemmän. Lisäksi kasvuhormoni mRNA: n pitoisuus kohosi myös maksasoluissa. Samoin monet siirtogeeniset eläimet, kuten lampaat, vuohet,siat, kanit jne. on myös tuotettu mikroinjektiotekniikalla.
in vitro-hedelmöitystekniikka (IVF)
termi in vitro tarkoittaa lasissa tai keinotekoisessa tilassa, ja IVF tarkoittaa sitä, että munasolun hedelmöitys siittiöillä tapahtuu lasissa.

siirtogeenisten hiirten tuotanto; MT, metioniini

Fig. 4.16. Transgeenisten hiirten tuotanto; MT, metioniini.

IVF-tekniikka kotieläimillä
nykyään eksogeeniset hormonit on kehitetty luonnollisesti ja yhdistelmä-DNA-tekniikalla, joita käytetään superovulaation indusoimiseen tuotantoeläimillä. Superovulaatio on ilmiö, jossa yksi nainen kerrallaan tuottaa hormonihoidolla normaalia enemmän munasoluja.
normaali lehmä tuottaa yhden tai kaksi munaa ovulaatioaikana, kun taas sama voi tuottaa 8-10 munaa, kun se joutuu superovulaation kohteeksi. Siksi eläin tuottaa normaalin lisääntymisen kautta noin 4-5 jälkeläistä elämässään, kun taas IVF-tekniikan avulla sama voi tuottaa 50-80 jälkeläistä elämässään. Yksityiskohtainen kuvaus: KS.lisääntymis-ja siirtogeenisten eläinten käsittely.
IVF-tekniikan ihmisillä
IVF-tekniikan kehitti professori Robert Winston. P. Steptoe ja R. Edwards tuottivat samalla tekniikalla maailman ensimmäisen koeputkessa syntyneen naisvauvan, Louise J. Brownin, 25. heinäkuuta 1978. Sen jälkeen vauvoja on syntynyt tähän mennessä yli 25 000.
aikaisemmat munasolut otettiin talteen potilaan munasarjoista laparoskoopin avulla. Pieni viilto tehdään juuri navan alapuolelle ja laparoskooppi otetaan käyttöön. Munat poistetaan ontolla neulalla. Yleensä vain yksi muna voidaan hankkia kerrallaan tietyn ajan kuluttua luonnollisella tavalla. Superovulaation avulla munia voi kuitenkin saada enemmän kerrallaan.
hormonia pistetään päivittäin noin 28 vuorokauden ajan. Joskus haittavaikutuksia voi esiintyä. Munat pidetään erityisessä nesteessä ja tutkitaan mikroskooppisesti mahdollisten vikojen varalta. Munat siirretään petrimaljaan, joka sisältää tuoretta siemennestettä. Sukusolujen hedelmöittyminen kestää 12-15 tuntia. Hedelmöityksen jälkeen tsygootti pidetään toisessa nesteessä kehon lämpötilassa. Solujen jakautumista havaitaan säännöllisesti. Kun alkio saavuttaa blastokystavaiheen, viimeisen kasvuvaiheen, se istutetaan kohtuun. Ei ole välttämätöntä, että kaikki istutetut alkiot kasvavat. Siihen liittyy monia komplikaatioita implantaation jälkeen. Siksi menestyksen saamiseksi yleensä kolme alkiota siirretään kohtuun kerrallaan. Näin syntyy yksi, kaksi tai kolme vauvaa menestyksen perusteella. Tätä prosessia kutsutaan tsygootti intrafallopian transfer (ZIFT). On toinenkin tekniikka, jossa munasolut ja siittiöt asetetaan munanjohtimeen hedelmöityksen helpottamiseksi. Tämä tunnetaan gamete intrafallopian siirto (lahja).
Intiassa on yhdeksän keskusta, kuten Mumbai, Kolata, Chenai, Delhi ja muut avustavat lapsettomia pariskuntia.
ziftin ja Giftin lisäksi mikroinjektiotekniikkaa käytetään myös oligospermisillä potilailla. Tässä yksi siittiö ruiskutetaan suoraan munasoluun hedelmöityksen helpottamiseksi.
Koeputkivauvoihin liittyvät ongelmat
vaikka IVF-tekniikka on siunaus lapsettomille pareille, siihen liittyy kuitenkin useita ongelmia, jos se kaupallistuu. Nämä ongelmat voivat olla uskonnollisia, eettisiä, tunneperäisiä tai poliittisia. Esimerkiksi katolinen kirkko ei hyväksy IVF-tekniikkaa, koska se julistaa, ettei hedelmöitystä tulisi koskaan ottaa pois kehosta. Lahja on hyväksyttävä, ZIFT ei. Muslimimaat kuten Malesia pitävät sperman luovutusta moraalittomana. Luovutetuista siittiöistä syntyneitä lapsia pidetään aviottomina. Intiasta ei kuitenkaan toistaiseksi ole kiistelty. Intian ensimmäinen spermapankki perustettiin New Delhiin tammikuussa 1994 auttamaan lapsettomia pariskuntia.
yksi tunne-elämän ongelmista on käyttämättömät ylimääräiset alkiot. Heitetäänkö heidät pois vai istutetaanko heidät sijaisäiteihin. Ensimmäinen on moraalinen kysymys. Sijaissynnyttäjät toimivat eläinten hautomona ja synnyttävät vauvan normaalin tiineyden jälkeen. He eivät edistä geneettistä materiaalia sellaisena kuin se tulee luovuttajilta. Siksi sijaissynnyttäjät voitaisiin kaupallistaa. Lapsi ei ole heidän oikea lapsensa. Saavatko luovutetun munasolun/sperman kautta syntyneet lapset yhteiskunnallista tai uskonnollista tunnustusta? Tunnetaanko lapset biologisista vanhemmistaan? Hyväksyvätkö heidän vanhempansa heidät?

Similar Posts

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.