Microinjection – Technique de génie génétique

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La microinjection

La microinjection est une technique de livraison d’ADN étranger dans une cellule vivante (une cellule, un œuf, un ovocyte, des embryons d’animaux) à travers une micropipette en verre. Une extrémité d’une micropipette en verre est chauffée jusqu’à ce que le verre soit quelque peu liquéfié. Il est rapidement étiré ce qui forme une pointe très fine à l’extrémité chauffée. La pointe de la pipette atteint environ 0,5 mm de diamètre, ce qui ressemble à une aiguille d’injection. Le processus de délivrance d’ADN étranger se fait sous un microscope puissant. Les cellules à microinjecter sont placées dans un récipient (Fig. 4.15). Une pipette de maintien est placée dans le champ de vision du microscope. La pipette de maintien maintient une cellule cible à l’extrémité lorsqu’elle est aspirée doucement. La pointe de la micropipette est injectée à travers la membrane de la cellule. Le contenu de l’aiguille est introduit dans le cytoplasme et l’aiguille vide est retirée.

 Une méthode de microinjection de la préparation d'ADN dans l'œuf

Fig. 4.15. Une méthode de microinjection de la préparation de l’ADN dans l’œuf.

Les ovocytes de xénope ont été largement utilisés pour l’étude de la transcription par microinjection car les ovocytes contiennent entre 6 000 et 100 000 molécules d’ARN polymérase ou plus que les cellules somatiques. La microinjection est techniquement facile en raison de la grande taille des ovocytes. Une partie du schéma endogène de régulation des gènes au cours du développement a été caractérisée (Wickens et Laskey, 1981). L’ADN injecté s’intègre de manière aléatoire à l’ADN nucléaire et son expression ne pourrait être possible que lorsque l’ADN étranger est attaché à une séquence promotrice appropriée. Il existe de nombreux exemples où différents types de cellules animales ont été microinjectées et transférées avec succès.
Rubin et Spradling (1982) ont introduit pour la première fois le gène Drosophile de la xanthine déshydrogénase dans un élément P (élément parental) qui a été microinjecté avec un élément P auxiliaire intact dans un embryon déficient pour ce gène. De tels embryons ont développé plus tard des mouches aux yeux de couleur rose que des yeux en mosaïque comme dans la première génération parentale.
Production d’Animaux transgéniques
En 1982, R.D. Palmiter de l’Université de Washington et R.L.Brinter de l’Université de Pennsylvanie a isolé le gène de l’hormone de croissance du lapin (p-globine), le gène de l’hormone de croissance humaine ((i-globine) ainsi que le gène de la thymidine kinase et lié séparément à la région promotrice de la souris associée au gène de la métallothionéine I (un gène codant pour une protéine de liaison aux métaux). Ceci a été joint au plasmide pBR322 pour produire les plasmides recombinants. Des ovules matures de souris adultes ont été récupérés chirurgicalement et fécondés avec des spermatozoïdes in vitro. Immédiatement, les ovules fécondés ont été micro-injectés avec des plasmides recombinants avant que les noyaux des spermatozoïdes et des ovules ne se soient fusionnés pour former un zygote diploïde. Les plasmides se combinent généralement de manière homologue les uns avec les autres au sein de l’œuf formant un long concatémère répété qui s’intègre ensuite de manière aléatoire pour donner des gènes répétés sur un seul site chromosomique. Les embryons modifiés ont ensuite été implantés dans l’utérus d’une mère souris hôte pour un développement ultérieur. Les souris résultantes sont appelées « souris transgéniques » car une partie du génome provient d’un autre organisme génétiquement non lié. En raison de l’introduction d’un gène étranger avant la fusion nucléaire, l’intégration chromosomique a lieu tôt et la descendance contient de nouveaux gènes. La taille et le poids corporel des progénitures étaient extrêmement plus grands que les progénitures normales (Fig. 4.16).

Dans une autre expérience (Palmiter et al 1982), des embryons de souris ont été injectés avec un fragment d’ADN contenant le gène de l’hormone de croissance du rat fusionné à la région promotrice du gène de la métallothionéine I de souris. Dans cette expérience, des fragments d’ADN linéaires ont été utilisés plutôt que des plasmides car ceux-ci s’intègrent plus efficacement dans les chromosomes de la souris. Par conséquent, 21 souris ont été produites, parmi lesquelles sept contenaient le gène de fusion. Six avaient un poids corporel deux fois plus important que les autres. Le niveau d’hormones de croissance a augmenté plusieurs fois (entre 200 et 800 fois) plus que le contrôle. En outre, le niveau d’ARNm de l’hormone de croissance a également été augmenté dans les cellules hépatiques. De même, de nombreux animaux transgéniques tels que les moutons, les chèvres, les porcs, les lapins, etc. ont également été produits par technique de micro-injection.
Technologie de fécondation in vitro (FIV)
Le terme in vitro désigne le verre ou l’état artificiel, et la FIV fait référence au fait que la fécondation de l’ovule par le sperme se produit dans la verrerie.

 Production de souris transgéniques; MT, méthionine

Fig. 4.16. Production de souris transgéniques; MT, méthionine.

Technologie de FIV chez les animaux d’élevage
De nos jours, des hormones exogènes ont été développées grâce à la technologie de l’ADN naturel et recombinant qui sont utilisées pour induire la superovulation chez les animaux d’élevage. La superovulation est un phénomène de production d’œufs supérieurs au nombre normal par traitement hormonal par une seule femelle à la fois.
Une vache normale produit un ou deux œufs pendant une période d’ovulation, alors qu’elle peut produire de 8 à 10 œufs lorsqu’elle est soumise à une superovulation. Par conséquent, grâce à une reproduction normale, un animal produit environ 4 à 5 progénitures dans sa vie, tandis que grâce à la technologie de FIV, il peut produire 50 à 80 progénitures dans sa vie. Pour une description détaillée, voir Manipulation de la Reproduction et des Animaux transgéniques.
Technologie de FIV chez l’homme
La technologie de FIV a été mise au point chez l’homme par le professeur Robert Winston. La même technique a été utilisée par P.Steptoe et R.Edwards pour produire le premier bébé femelle éprouvette au monde, Louise J. Brown, le 25 juillet 1978. Depuis lors, plus de 25 000 bébés ont été produits à ce jour.
Des ovules antérieurs ont été récupérés de l’ovaire de la patiente à l’aide d’un laparoscope. Une petite incision est faite juste en dessous du nombril et le laparoscope est introduit. Les œufs sont enlevés avec une aiguille creuse. Généralement, un seul œuf peut être obtenu à la fois après une certaine période de manière naturelle. Mais grâce à la superovulation, plus d’œufs peuvent être obtenus à la fois.

L’hormone est injectée quotidiennement pendant environ 28 jours. Parfois, des effets secondaires peuvent survenir. Les œufs sont conservés dans un liquide spécial et examinés au microscope pour détecter tout défaut. Les œufs sont transférés dans une boîte de pétri contenant du sperme frais. Les gamètes mettent 12 à 15 heures à fertiliser. Après la fécondation, le zygote est conservé dans un autre liquide à la température corporelle. La division cellulaire est observée régulièrement. Lorsque l’embryon atteint le stade de blastocyste, le dernier stade de croissance, il est implanté dans l’utérus. Il n’est pas nécessaire que tous les embryons implantés se développent. Il y a beaucoup de complications qui y sont liées après l’implantation. Par conséquent, pour réussir, trois embryons sont généralement transférés dans l’utérus à la fois. Il en résulte la naissance d’un, deux ou trois bébés en fonction du succès. Ce processus est appelé transfert intrafallopique zygote (ZIFT). Il existe une autre technique où les ovules et les spermatozoïdes sont placés dans les trompes de Fallope pour faciliter la fécondation. C’est ce qu’on appelle le transfert intrafallopique de gamètes (DON).
En Inde, il existe neuf centres comme Mumbai, Kolata, Chenai, Delhi et d’autres qui aident les couples sans enfants.
En plus de ZIFT et GIFT, la technique de microinjection est également appliquée chez les patients oligospermiques. Ici, un spermatozoïde est directement injecté dans un ovule pour faciliter la fécondation.
Problèmes liés aux bébés éprouvettes
Bien que la technologie de FIV soit une aubaine pour les couples sans enfants, il existe pourtant plusieurs problèmes liés à celle-ci, si elle devient commercialisée. Ces problèmes peuvent être religieux, éthiques, émotionnels ou politiques. Par exemple, l’Église catholique n’approuve pas la technique de FIV car elle proclame que la conception ne doit jamais être retirée du corps. Le CADEAU est acceptable, alors que ZIFT ne l’est pas. Les pays musulmans comme la Malaisie croient que le don de sperme est immoral. Les enfants nés de dons de sperme sont considérés comme illégitimes. Cependant, il n’y a pas de controverse en Inde jusqu’à présent. En Inde, la première banque de sperme a été créée à New Delhi en janvier 1994 pour aider les couples sans enfants.
L’un des problèmes émotionnels est les embryons supplémentaires inutilisés. Qu’elles soient jetées ou implantées chez des mères porteuses. La première est la question morale. Les mères porteuses agissent comme incubateur d’animaux et accouchent après la gestation normale. Ils ne fournissent pas le matériel génétique car il provient des donneurs. Par conséquent, les mères porteuses pourraient être commercialisées. L’enfant ne sera pas leur vrai. Les enfants nés d’ovules/spermatozoïdes donnés recevront-ils une reconnaissance sociale ou religieuse? Les enfants seront-ils connus de leurs parents biologiques? Leurs parents les accepteront-ils?

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