Mikroinjekció-géntechnológiai technika

author
8 minutes, 31 seconds Read

mikroinjekció

a mikroinjekció az idegen DNS élő sejtbe (sejt, tojás, petesejt, állatok embriói) üveg mikropipettán keresztül történő továbbításának technikája. Az üveg mikropipetta egyik végét addig melegítjük, amíg az üveg kissé folyékony lesz. Gyorsan megnyúlik, ami nagyon finom hegyet képez a fűtött végén. A pipetta hegye eléri a körülbelül 0,5 mm átmérőjű, amely hasonlít egy injekciós tű. Az idegen DNS leadásának folyamata erős mikroszkóp alatt történik. A mikroinjekciózandó sejteket egy tartályba helyezzük (ábra. 4.15). A mikroszkóp látómezőjébe egy tartó pipettát helyeznek. A tartó pipetta egy célcellát tart a csúcsán, amikor óvatosan szívja be. A mikropipetta csúcsát a sejt membránján keresztül injektáljuk. A tű tartalmát a citoplazmába juttatják, és az üres tűt kiveszik.

a módszer a mikroinjekció a DNS-készítmény tojás

ábra. 4.15. A DNS-készítmény mikroinjekciójának módszere a tojásban.

a Xenopus petesejteket széles körben használják a mikroinjekcióval történő transzkripció vizsgálatához, mivel a petesejtek 6000-100 000 vagy több RNS polimeráz molekulát tartalmaznak, mint a szomatikus sejtek. A mikroinjekció technikailag könnyű a petesejtek nagy mérete miatt. A génszabályozás endogén mintázatának egy részét a fejlődés során jellemezték (Wickens and Laskey, 1981). Az injektált DNS véletlenszerűen integrálódik a nukleáris DNS-sel, expressziója csak akkor lehetséges, ha az idegen DNS megfelelő promoter szekvenciához kapcsolódik. Számos példa van arra, hogy különböző típusú állati sejteket mikroinjektáltak és sikeresen átvittek.
Rubin és Spradling (1982) először vezette be a Drosophila gént a xantin-dehidrogenáz számára egy P-elembe (szülői elem), amelyet egy intakt helper p-elemmel mikroinjekcióztak az embrió hiányába. Az ilyen embriók később rózsás színű szemekkel fejlődtek ki, mint a mozaikszemek, mint az első szülői generációban.
transzgenikus állatok előállítása
1982-ben, R. D. Palmiter a Washington Egyetemen és R. L.Brinter a Pennsylvaniai Egyetemen izolálta a nyúl növekedési hormon (p-globin) gént, az emberi növekedési hormon ((i-globin) gént, valamint a timidin-kináz gént, és külön kapcsolódott az egér promoter régiójához, amely a metallothionein I génhez kapcsolódik (egy olyan gén, amely fémkötő fehérjét kódol). Ezt összekapcsoltuk a pbr322 plazmiddal, hogy előállítsuk a rekombináns plazmidokat. A felnőtt egerekből származó érett petesejteket műtéti úton nyerték vissza, és in vitro spermiumokkal megtermékenyítették. Azonnal a megtermékenyített petesejteket rekombináns plazmidokkal mikroinjekciózták, mielőtt a spermium és a petesejt magjai összeolvadtak, hogy diploid zigótát képezzenek. A plazmidok általában homológ módon kombinálódnak egymással a tojáson belül, hosszú ismétlődő concatemert képezve, amely véletlenszerűen integrálódik, hogy ismételt géneket adjon egyetlen kromoszómális helyen. A mesterséges embriókat ezután beültették egy gazda egér anya méhébe a további fejlődés érdekében. A kapott egereket transzgenikus egereknek nevezzük, mivel a genom egy része egy másik genetikailag nem kapcsolódó szervezetből származik. Az idegen gén magfúzió előtti bevezetése miatt a kromoszóma-integráció korán megtörténik, és az utódok új géneket tartalmaznak. Az utódok mérete és testtömege rendkívül nagyobb volt, mint a normálisaké (ábra. 4.16).

egy másik kísérletben (Palmiter et al 1982) egér embriókat injektáltak egy DNS-fragmenssel, amely a patkány növekedési hormon gént tartalmazta az egér metallothionein I gén promoter régiójához fuzionálva. Ebben a kísérletben lineáris DNS-fragmenseket használtunk plazmidok helyett, mivel ezek hatékonyabban integrálódnak az egér kromoszómáiba. Következésképpen 21 egeret állítottak elő, köztük hét tartalmazta a fúziós gént. Hat volt kétszer nagyobb testtömeg, mint a többiek. A növekedési hormonok szintje sokszor (200-800-szor) nőtt, mint a kontroll. Ezenkívül a növekedési hormon mRNS szintje is emelkedett a májsejtekben. Hasonlóképpen sok transzgenikus állat, például juh, kecske, sertés, nyúl stb. mikroinjekciós technikával is előállították.
In vitro megtermékenyítés (IVF) technológia
az in vitro kifejezés üvegben vagy mesterséges állapotban jelent, az IVF pedig arra a tényre utal, hogy a petesejt spermával történő megtermékenyítése üvegárukban történik.

 transzgenikus egerek előállítása; MT, metionin

ábra. 4.16. Transzgenikus egerek előállítása; MT, metionin.

IVF technológia haszonállatokban
manapság exogén hormonokat fejlesztettek ki természetes és rekombináns DNS technológiával, amelyeket a haszonállatok szuperovulációjának indukálására használnak. A szuperovuláció olyan jelenség, hogy a normálnál nagyobb számú petesejtet termel egyszerre egyetlen nőstény hormonkezelésével.
egy normál tehén egy vagy két tojást termel ovulációs periódus alatt, míg ugyanez 8-10 tojást képes előállítani, ha szuperovulációnak vetik alá. Ezért a normál szaporodás révén az állat életében körülbelül 4-5 utódot hoz létre, míg az IVF technológia révén ugyanez 50-80 utódot hozhat életében. A részletes leírást lásd: reprodukciós és transzgenikus állatok manipulálása.
IVF technológia emberekben
az IVF technológiát Robert Winston professzor vezette be az emberekben. Ugyanezt a technikát használta P. Steptoe és R. Edwards, hogy készítsen a világ első kémcsöves női baba, Louise J. Brown, július 25-én, 1978. Azóta több mint 25 000 csecsemőt hoztak létre eddig.
a korábbi petesejteket laparoszkóppal nyerték ki a beteg petefészkéből. A köldök alatt egy kis bemetszés történik, és a laparoszkópot bevezetik. A tojásokat üreges tűvel távolítják el. Általában csak egy tojást lehet beszerezni egy bizonyos időszak után természetes módon. De a szuperovuláció révén egyszerre több tojást lehet beszerezni.
a hormont naponta körülbelül 28 napig injektálják. Néha mellékhatások léphetnek fel. A tojásokat speciális folyadékban tartják, és mikroszkóposan megvizsgálják az esetleges hibákat. A tojásokat egy friss spermát tartalmazó Petri-csészébe helyezzük. Az ivarsejtek megtermékenyítése 12-15 órát vesz igénybe. A megtermékenyítés után a zigótát egy másik folyadékban tartják a testhőmérsékleten. A sejtosztódást rendszeresen megfigyelik. Amikor az embrió eléri a blastocysta stádiumot, a növekedés utolsó szakaszát, beültetik a méhbe. Nem szükséges, hogy az összes beültetett embrió növekedjen. A beültetés után számos szövődmény kapcsolódik hozzá. Ezért a siker elérése érdekében általában három embriót visznek át a méhbe egyszerre. Ez egy, két vagy három csecsemő születését eredményezi a siker alapján. Ezt a folyamatot zigóta intrafallopiás transzfernek (ZIFT) nevezik. Van egy másik technika, ahol a petesejteket és a spermákat a petevezetékbe helyezik a megtermékenyítés megkönnyítése érdekében. Ez az úgynevezett gamete intrafallopian transzfer (ajándék).
Indiában kilenc központ működik, mint Mumbai, Kolata, Chenai, Delhi és mások, akik a gyermektelen párokat segítik.
a Zift és a GIFT mellett a mikroinjekciós technikát oligospermiás betegeknél is alkalmazzák. Itt egy spermát közvetlenül injektálnak egy petesejtbe a megtermékenyítés megkönnyítése érdekében.
a kémcsöves csecsemőkkel kapcsolatos problémák
bár az IVF technológia áldás a gyermektelen párok számára, mégis számos probléma merül fel vele kapcsolatban, Ha kereskedelmi forgalomba kerül. Ezek a problémák lehetnek vallási, etikai, érzelmi vagy politikai jellegűek. Például a katolikus egyház nem hagyja jóvá az IVF technikát, mivel kijelenti, hogy a fogantatást soha nem szabad kivenni a testből. Az ajándék elfogadható, míg ZIFT nem. Az olyan muszlim országok, mint Malajzia, erkölcstelennek tartják a spermadományozást. Az adományozott spermából származó gyermekeket illegitimnek tekintik. Indiában azonban eddig nincs vita. Indiában 1994 januárjában Új-Delhiben létrehozták az első spermabankot a gyermektelen párok megsegítésére.
az egyik érzelmi probléma a fel nem használt extra embriók. Függetlenül attól, hogy eldobják-e őket, vagy beültetik-e őket a helyettesítő anyákba. Az első az erkölcsi kérdés. A béranyák állati inkubátorként működnek, és a normális vemhesség után szállítják a babát. Nem adják hozzá a genetikai anyagokat, mivel azok a donoroktól származnak. Ezért a helyettesítő anyákat kereskedelmi forgalomba lehetne hozni. A gyermek nem lesz az igazi. Az adományozott petesejt/Sperma révén született gyermekek társadalmi vagy vallási elismerést kapnak-e? Ismerik-e a gyerekeket biológiai szüleikről? A szüleik elfogadják őket?

Similar Posts

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.