Microiniezione – Tecnica di ingegneria genetica

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Microiniezione

La microiniezione è una tecnica di consegna di DNA estraneo in una cellula vivente (una cellula, uovo, ovocita, embrioni di animali) attraverso una micropipetta di vetro. Un’estremità di una micropipetta di vetro viene riscaldata fino a quando il vetro diventa un po ‘ liquefatto. È rapidamente allungato che forma una punta molto fine all’estremità riscaldata. La punta della pipetta raggiunge un diametro di circa 0,5 mm che assomiglia ad un ago per iniezione. Il processo di consegna del DNA estraneo viene eseguito sotto un potente microscopio. Le cellule da microiniettare sono poste in un contenitore (Fig. 4.15). Una pipetta di tenuta è posizionata nel campo visivo del microscopio. La pipetta tiene una cella bersaglio sulla punta quando viene aspirata delicatamente. La punta della micropipetta viene iniettata attraverso la membrana della cellula. Il contenuto dell’ago viene consegnato nel citoplasma e l’ago vuoto viene estratto.

 Un metodo di microiniezione della preparazione del DNA nell'uovo

Fig. 4.15. Un metodo di microiniezione della preparazione del DNA nell’uovo.

Gli ovociti di Xenopus sono stati ampiamente utilizzati per lo studio della trascrizione per microiniezione perché gli ovociti contengono tra 6.000 e 100.000 o più molecole di RNA polimerasi rispetto alle cellule somatiche. La microiniezione è tecnicamente facile a causa delle grandi dimensioni degli ovociti. Alcuni dei pattern endogeni della regolazione genica durante lo sviluppo sono stati caratterizzati (Wickens e Laskey, 1981). Il DNA iniettato si integra casualmente con il DNA nucleare e la sua espressione potrebbe essere possibile solo quando il DNA estraneo è collegato a una sequenza di promotore adatta. Ci sono molti esempi in cui diversi tipi di cellule animali sono stati microiniettati e trasferiti con successo.
Rubin e Spradling (1982) per la prima volta hanno introdotto il gene Drosophila per la xantina deidrogenasi in un elemento P (elemento parentale) che è stato microiniettato con un elemento P helper intatto nell’embrione carente per questo gene. Tali embrioni in seguito sviluppato mosche con gli occhi di colore roseo di occhi mosaico come nella prima generazione dei genitori.
Produzione di animali transgenici
Nel 1982, R. D. Palmiter della Washington University e R. L.Brinter dell’Università della Pennsylvania ha isolato il gene dell’ormone della crescita del coniglio (p-globina), il gene dell’ormone della crescita umano ((i-globina) e il gene della timidina chinasi e collegato separatamente alla regione del promotore del topo associato al gene metallotioneina I (un gene che codifica una proteina legante il metallo). Questo è stato unito al plasmide pBR322 per produrre i plasmidi ricombinanti. Le uova mature di topo adulto sono state recuperate chirurgicamente e fecondate con spermatozoi in vitro. Immediatamente le uova fecondate sono state microiniettate con plasmidi ricombinanti prima che lo sperma e i nuclei dell’uovo si siano fusi per formare uno zigote diploide. I plasmidi generalmente si combinano omologamente tra loro all’interno dell’uovo formando un concatemer ripetuto lungo che poi si integra casualmente per dare geni ripetuti in un singolo sito cromosomico. Gli embrioni ingegnerizzati sono stati poi impiantati nell’utero di una madre di topo ospite per un ulteriore sviluppo. I topi risultanti sono chiamati “topi transgenici” poiché parte del genoma proviene da un altro organismo geneticamente non correlato. A causa dell’introduzione di geni estranei prima della fusione nucleare, l’integrazione cromosomica avviene precocemente e la progenie contiene nuovi geni. Le dimensioni e il peso corporeo delle progenie erano estremamente più grandi di quelle normali (Fig. 4.16).

In un altro esperimento ( Palmiter et al 1982) ha iniettato embrioni di topo con un frammento di DNA contenente il gene dell’ormone della crescita del ratto fuso alla regione promotrice del gene metallotioneina I del topo. In questo esperimento, sono stati utilizzati frammenti di DNA lineari piuttosto che plasmidi perché questi si integrano in modo più efficiente nei cromosomi del topo. Di conseguenza, sono stati prodotti 21 topi, tra cui sette contenevano il gene della fusione. Sei erano due volte più grandi in peso corporeo rispetto agli altri. Il livello degli ormoni della crescita è aumentato molte volte (tra 200-800 volte) più del controllo. Inoltre, il livello di mRNA dell’ormone della crescita è stato aumentato anche nelle cellule epatiche. Allo stesso modo, molti animali transgenici come pecore, capre, maiali, conigli, ecc. sono stati prodotti anche attraverso la tecnica di microiniezione.
Tecnologia di fecondazione in vitro (IVF)
Il termine in vitro significa in vetro o in condizioni artificiali e la fecondazione in vitro si riferisce al fatto che la fecondazione dell’uovo da parte dello sperma avviene in vetreria.

 Produzione di topi transgenici; MT, metionina

Fig. 4.16. Produzione di topi transgenici; MT, metionina.

Tecnologia IVF negli animali da allevamento
Oggigiorno, gli ormoni esogeni sono stati sviluppati attraverso la tecnologia del DNA naturale e ricombinante che vengono utilizzati per indurre la superovulazione negli animali da allevamento. La superovulazione è un fenomeno di produzione maggiore del normale numero di uova attraverso il trattamento ormonale da parte di una singola femmina alla volta.
Una mucca normale produce una o due uova durante un periodo ovulatorio, mentre la stessa può produrre 8-10 uova se sottoposta a superovulazione. Pertanto, attraverso la riproduzione normale, un animale produce circa 4-5 discendenti nella sua vita, mentre attraverso la tecnologia IVF lo stesso può produrre 50-80 discendenti nella sua vita. Per una descrizione dettagliata vedere Manipolazione della riproduzione e animali transgenici.
Tecnologia FIV negli esseri umani
La tecnologia FIV è stata pioniera negli esseri umani dal Prof. Robert Winston. La stessa tecnica è stata utilizzata da P. Steptoe e R. Edwards per produrre il primo bambino femmina in provetta al mondo, Louise J. Brown, il 25 luglio 1978. Da allora più di 25.000 bambini sono stati prodotti finora.
Le uova precedenti sono state recuperate dall’ovaio del paziente utilizzando laparoscopio. Una piccola incisione viene eseguita appena sotto l’ombelico e viene introdotto il laparoscopio. Le uova vengono rimosse con un ago cavo. Generalmente, solo un singolo uovo può essere procurato alla volta dopo un certo periodo in modo naturale. Ma attraverso la superovulazione si possono ottenere più uova alla volta.

L’ormone viene iniettato ogni giorno per circa 28 giorni. A volte possono verificarsi effetti collaterali. Le uova sono conservate in un fluido speciale ed esaminate microscopicamente per eventuali difetti. Le uova vengono trasferite in una capsula di Petri contenente sperma fresco. I gameti impiegano 12-15 ore per concimare. Dopo la fecondazione lo zigote viene mantenuto in un altro fluido alla temperatura corporea. La divisione cellulare è osservata regolarmente. Quando l’embrione raggiunge lo stadio di blastocisti, l’ultimo stadio di crescita, viene impiantato nell’utero. Non è necessario che tutti gli embrioni impiantati crescano. Ci sono molte complicazioni legate ad esso dopo l’impianto. Pertanto, per ottenere il successo generalmente tre embrioni vengono trasferiti nell’utero alla volta. Ciò si traduce in nascita di uno, due o tre bambini in base al successo. Questo processo è chiamato come trasferimento intrafallopiano dello zigote (ZIFT). C’è un’altra tecnica in cui uova e spermatozoi sono collocati nella tuba di Falloppio per facilitare la fecondazione. Questo è noto come trasferimento intrafallopiano del gamete (REGALO).
In India, ci sono nove centri come Mumbai, Kolata, Chenai, Delhi e altri che assistono le coppie senza figli.
Oltre a ZIFT e GIFT, la tecnica di microiniezione viene applicata anche nei pazienti oligospermici. Qui, uno sperma viene iniettato direttamente in un uovo per facilitare la fecondazione.
Problemi relativi ai bambini in provetta
Sebbene la tecnologia IVF sia un vantaggio per le coppie senza figli, tuttavia ci sono diversi problemi ad essa correlati, se viene commercializzata. Questi problemi possono essere religiosi, etici, emotivi o politici. Ad esempio, la Chiesa cattolica non approva la tecnica della fecondazione in vitro in quanto proclama che il concepimento non dovrebbe mai essere tolto dal corpo. Il REGALO è accettabile, mentre ZIFT non lo è. Paesi musulmani come la Malesia credono che la donazione di sperma come immorale. I bambini nati da spermatozoi donati sono considerati illegittimi. Tuttavia, non ci sono polemiche in India finora. In India la prima banca del seme è stata istituita a Nuova Delhi nel gennaio 1994 per aiutare le coppie senza figli.
Uno dei problemi emotivi sono gli embrioni extra inutilizzati. Se saranno gettati via o impiantati in madri surrogate. Il primo è la questione morale. Le madri surrogate fungono da incubatore di animali e consegnano il bambino dopo la normale gestazione. Non contribuiscono al materiale genetico in quanto proviene dai donatori. Pertanto, le madri surrogate potrebbero essere commercializzate. Il bambino non sarà il loro vero. I bambini portati attraverso ovuli/spermatozoi donati riceveranno un riconoscimento sociale o religioso? I bambini saranno noti dei loro genitori biologici? I loro genitori li accetteranno?

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