マイクロインジェクション-遺伝子工学技術

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マイクロインジェクション

マイクロインジェクションは、ガラスマイクロピペットを介して生きている細胞(細胞、卵、卵母細胞、動物の胚)に外来DNAを送達する技術である。 ガラスマイクロピペットの一方の端は、ガラスが幾分液化するまで加熱される。 加熱された端部に非常に微細な先端を形成するのはすぐに引き伸ばされる。 ピペットの先端は注入の針に類似している約0.5mmの直径に達します。 外来DNAを送達するプロセスは、強力な顕微鏡下で行われる。 微小注入される細胞は、容器内に配置される(図2)。 4.15). 保持ピペットは、顕微鏡の視野内に配置される。 保持ピペットは、穏やかに吸引されたときに先端に標的細胞を保持する。 マイクロピペットの先端は、細胞の膜を通って注入される。 針の内容物は細胞質に送達され、空の針が取り出される。

卵中のDNA調製物のマイクロインジェクション法

図。 4.15. 卵中のDNA調製物のマイクロインジェクションの方法。

アフリカツメガエルの卵母細胞は、体細胞よりも6,000から100,000以上のRNAポリメラーゼ分子を含むため、マイクロインジェクションによる転写の研究に広く使用されている。 マイクロインジェクションは、卵母細胞のサイズが大きいため、技術的に容易である。 発達中の遺伝子調節の内因性パターンのいくつかが特徴づけられている(Wickens and Laskey、1981)。 注入されたDNAは核DNAとランダムに統合され、その発現は、外来DNAが適切なプロモーター配列に結合している場合にのみ可能であり得る。 さまざまな種類の動物細胞がマイクロインジェクションされ、正常に移植された多くの例があります。
Rubin and Spradling(1982)は、キサンチンデヒドロゲナーゼのショウジョウバエ遺伝子をp要素(親要素)に導入し、この遺伝子を欠損した胚に無傷のヘルパー P要素でマイクロインジェク このような胚は後に、最初の親世代のようにモザイク目よりもバラ色の目を持つハエを発達させた。
トランスジェニック動物の生産
1982年、ワシントン大学のR.D.PalmiterとR.L.ペンシルバニア大学のbrinterはウサギ成長ホルモン(p-グロビン)遺伝子,ヒト成長ホルモン((i-グロビン)遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子を単離し,メタロチオネインi遺伝子(金属結合蛋白質をコードする遺伝子)に関連するマウスのプロモーター領域と別々に結合した。 これをpBR3 2 2プラスミドに結合して組換えプラスミドを作製した。 成体マウスの成熟卵を外科的に回収し,invitroで精子で受精した。 精子と卵核が融合して二倍体接合体を形成する前に、受精卵を組換えプラスミドで直ちにマイクロインジェクションした。 プラスミドは一般に、卵内で互いに相同的に結合し、長い反復コンカテマーを形成し、その後、ランダムに統合して単一の染色体部位に反復遺伝子を与える。 その後、設計された胚を、さらなる発達のために宿主マウスの母親の子宮に移植した。 得られたマウスは、ゲノムの一部が遺伝的に無関係な別の生物から来ているので、”トランスジェニックマウス”と呼ばれています。 核融合前の外来遺伝子の導入により、染色体統合は早期に起こり、子孫には新しい遺伝子が含まれています。 子孫の大きさと体重は正常なものよりも非常に大きかった(図。 4.16).
別の実験(Palmiter et al1982)では、マウスのメタロチオネインI遺伝子のプロモーター領域に融合したラット成長ホルモン遺伝子を含むDNA断片をマウス胚に注入した。 この実験では、線状DNA断片は、これらがマウスの染色体に、より効率的に統合するので、プラスミドではなく使用されました。 その結果、21匹のマウスが生産され、そのうち7匹には融合遺伝子が含まれていました。 六つは他のものよりも体重が二倍大きかった。 成長ホルモンのレベルは、コントロールよりも何度も(200-800倍の間)増加した。 さらに,成長ホルモンmrnaのレベルは肝細胞でも増加した。 同様に、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、等のような多くのトランスジェニック動物。 またmicroinjectionの技術によって作り出されました。
体外受精(IVF)技術
in vitroという用語は、ガラスまたは人工的な状態を意味し、IVFは、精子による卵の受精がガラス製品で起こることを指す。

トランスジェニックマウスの生産;MT,メチオニン

Fig. 4.16. トランスジェニックマウスの産生;MT,メチオニン。

家畜におけるIVF技術
今日では、外因性ホルモンは、家畜の過排卵を誘導するために使用される自然および組換えDNA技術によって開発されています。 過排卵は、一度に単一の女性によるホルモン治療を通じて卵の通常の数よりも多くを生産する現象です。
通常の牛は排卵期に1つまたは2つの卵を産生するが、過排卵を受けると8-10個の卵を産生することがある。 したがって、通常の生殖を通じて、動物は彼女の人生で約4-5の子孫を産生し、IVF技術を通じて同じものが彼女の人生で50-80の子孫を産生することがで 詳細な説明については、生殖およびトランスジェニック動物の操作を参照してください。
ヒトにおける体外受精技術
IVF技術は、Robert Winston教授によってヒトで開拓されました。 同じ技術がP.SteptoeとR.Edwardsによって1978年7月25日に世界初の試験管の女性の赤ちゃん、Louise J.Brownを生産するために使用されました。 それ以来、これまでに25,000人以上の赤ちゃんが生産されています。
以前の卵は腹腔鏡を用いて患者の卵巣から回収された。 小さい切り傷は臍の下でちょうどなされ、laparoscopeは導入されます。 卵は中空の針で除去される。 一般的に、単一の卵だけが自然な方法で一定期間後に一度に調達することができます。 しかし、過排卵によって、より多くの卵を一度に得ることができる。
ホルモンは約28日間毎日注入されます。 時には副作用が起こることがあります。 卵は特別な液体に保管され、欠陥がないか顕微鏡的に検査されます。 卵は新鮮な精液を含むペトリ皿に移されます。 配偶子は受精するのに12-15時間かかります。 受精後、接合体は体温で別の体液中に保持される。 細胞分裂は定期的に観察される。 胚が胚盤胞の段階、成長の最後の段階に達すると、それは子宮に移植されます。 移植されたすべての胚が成長する必要はありません。 移植後にそれに関連する多くの合併症があります。 したがって、成功を得るために、一般的に三つの胚は、一度に子宮に転送されます。 これは成功に基づいて1、2または3人の赤ん坊の生れで起因する。 このプロセスは、受精卵卵内転送(ZIFT)と呼ばれています。 卵と精子が受精を容易にするために卵管に配置される別の技術があります。 これは配偶子卵内移動(GIFT)として知られています。
インドには、ムンバイ、コラタ、チェナイ、デリーなどの9つのセンターがあり、子どものいないカップルを支援している。
ZIFTおよびGIFTに加えて、マイクロインジェクション技術は、乏精子症患者にも適用される。 ここでは、受精を容易にするために、1つの精子を卵に直接注入する。
試験管赤ちゃんに関する問題
体外受精技術は子供のいないカップルには恩恵ですが、製品化されればそれに関連するいくつかの問題があります。 これらの問題は、宗教的、倫理的、感情的または政治的である可能性があります。 例えば、カトリック教会は、受胎が体から取り出されるべきではないと宣言しているため、体外受精技術を承認していません。 ギフトは許容されますが、ZIFTは許容されません。 マレーシアのようなイスラム教徒の国は、精子の寄付を不道徳だと信じています。 寄付された精子を負担した子供は非嫡出子とみなされます。 しかし、これまでのところ、インドでは論争はありません。 インドでは、最初の精子銀行は、1994年1月にニューデリーで子供のいないカップルを支援するために設立されました。
感情的な問題の一つは、未使用の余分な胚です。 彼らが捨てられるか、代理母に移植されるかどうか。 最初のものは道徳的な質問です。 代理母は動物の定温器として機能し、正常な妊娠の後で赤ん坊を渡します。 それはドナーから来るように、彼らは遺伝物質に貢献していません。 したがって、代理母は商品化することができました。 子供は彼らの本当のものではありません。 寄付された卵子/精子を介して負担された子供たちは、社会的または宗教的な認識を与えられますか? 子供たちは彼らの生物学的親の知られているのだろうか? 彼らの両親はそれらを受け入れるのだろうか?

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