Mikroinjektion-Genteknisk teknik

author
6 minutes, 14 seconds Read

mikroinjektion

mikroinjektion er en teknik til at levere fremmed DNA i en levende celle (en celle, æg, oocyt, embryoner af dyr) gennem en glasmikropipette. Den ene ende af en glasmikropipette opvarmes, indtil glasset bliver noget flydende. Det strækkes hurtigt, hvilket danner en meget fin spids i den opvarmede ende. Spidsen af pipetten når en diameter på ca. 0,5 mm, som ligner en injektionsnål. Processen med at levere fremmed DNA udføres under et kraftigt mikroskop. Celler, der skal mikroinjekteres, placeres i en beholder (Fig. 4.15). En holdepipette placeres i mikroskopets synsfelt. Holdepipetten holder en målcelle ved spidsen, når den suges forsigtigt. Spidsen af mikropipetten injiceres gennem cellemembranen. Indholdet af nålen leveres i cytoplasmaet, og den tomme nål tages ud.

en metode til mikroinjektion af DNA-præparat i æg

Fig. 4.15. En metode til mikroinjektion af DNA-præparat i æg.

Ksenopus-oocytter er blevet anvendt i vid udstrækning til undersøgelse af transkription ved mikroinjektion, fordi oocytter indeholder mellem 6.000 og 100.000 eller flere RNA-polymerasemolekyler end somatiske celler. Mikroinjektion er teknisk let på grund af stor størrelse af oocytter. Noget af det endogene mønster af genregulering under udvikling er blevet karakteriseret (væge og Laskey, 1981). Det injicerede DNA integreres tilfældigt med nukleart DNA, og dets ekspression kunne kun være mulig, når det fremmede DNA er bundet til en passende promotorsekvens. Der er mange eksempler, hvor forskellige typer dyreceller er blevet mikroinjiceret og med succes overført.
Rubin og Spradling (1982) introducerede for første gang Drosophila-genet for ksanthindehydrogenase i et P-element (forældreelement), som blev mikroinjiceret med et intakt hjælper-p-element i embryo mangelfuldt for dette gen. Sådanne embryoner udviklede senere fluer med rosenrøde øjne end mosaikøjne som i den første forældregeneration.
produktion af transgene dyr
i 1982, R. D. Palmiter fra universitetet og R. L.Brinter fra Pennsylvanian University isolerede kaninvæksthormonet (p-globin)-genet, humant væksthormon ((i-globin) – genet såvel som thymidinkinase-genet og bundet separat til promotorregionen af mus forbundet med metallothionein i-genet (et gen, der koder for et metalbindende protein). Dette blev forbundet med pbr322 plasmid for at producere de rekombinante plasmider. Modne æg fra voksne mus blev udvundet kirurgisk og befrugtet med sædceller in vitro. Umiddelbart blev de befrugtede æg mikroinjiceret med rekombinante plasmider, før sæd-og ægkernerne er smeltet sammen til dannelse af en diploid kindtand. Plasmiderne kombineres generelt homologt med hinanden i ægget og danner en lang gentagen concatemer, som derefter integreres tilfældigt for at give gentagne gener på et enkelt kromosomalt sted. De konstruerede embryoner blev derefter implanteret i livmoderen hos en værtsmusemor til videre udvikling. De resulterende mus kaldes ‘transgene mus’, da en del af genomet kommer fra en anden genetisk ikke-relateret organisme. På grund af introduktion af fremmed gen før nuklear fusion finder kromosomal integration sted tidligt, og afkom indeholder nye gener. Størrelse og kropsvægt af afkom var ekstremt større end de normale (Fig. 4.16).

i et andet eksperiment ( Palmiter et al 1982) injicerede musembryoer med et DNA-fragment indeholdende rottevæksthormongenet smeltet sammen med promotorregionen af musemetallothionein i-genet. I dette eksperiment blev lineære DNA-fragmenter anvendt snarere end plasmider, fordi disse integreres mere effektivt i musekromosomerne. Følgelig blev der produceret 21 mus, blandt dem syv indeholdt fusionsgenet. Seks var to gange større i kropsvægt end de andre. Niveauet af væksthormoner steg mange gange (mellem 200-800 gange) mere end kontrollen. Derudover blev niveauet af væksthormon mRNA også øget i leverceller. Tilsvarende er mange transgene dyr som får, ged, svin, kanin osv. er også blevet produceret gennem mikroinjektionsteknik.
in vitro fertilisering (IVF) teknologi
udtrykket in vitro betyder i glas eller i kunstig tilstand, og IVF henviser til det faktum, at befrugtning af æg med sæd forekommer i glasvarer.

produktion af transgene mus; MT, methionin

Fig. 4.16. Produktion af transgene mus; MT, methionin.

IVF-teknologi hos husdyr
i dag er eksogene hormoner udviklet gennem naturlig og rekombinant DNA-teknologi, der bruges til at inducere superovulation hos husdyr. Superovulation er et fænomen, der producerer større end det normale antal æg gennem hormonbehandling af en enkelt kvinde ad gangen.
en normal ko producerer et eller to æg i en ovulatorisk periode, mens den samme kan producere 8-10 æg, når den udsættes for superovulation. Derfor producerer et dyr gennem normal reproduktion omkring 4-5 afkom i sit liv, mens det gennem IVF-teknologi kan producere 50-80 afkom i sit liv. For en detaljeret beskrivelse se Manipulation af reproduktion og transgene dyr.
IVF-teknologi hos mennesker
IVF-teknologi blev banebrydende hos mennesker af Prof. Den samme teknik blev brugt af P. Steptoe og R. Edvard til at producere verdens første reagensglas kvindelige baby, Louise J. brun, den 25.juli 1978. Siden da er der produceret mere end 25.000 babyer indtil videre.
tidligere æg blev udvundet fra patientens æggestok ved hjælp af laparoskop. Et lille snit er lavet lige under navlen, og laparoskopet introduceres. Æg fjernes med en hul nål. Generelt kan kun et enkelt æg indkøbes ad gangen efter en bestemt periode på naturlig måde. Men gennem superovulation kan der opnås flere æg ad gangen.
hormonet injiceres dagligt i cirka 28 dage. Nogle gange kan bivirkninger finde sted. Æggene opbevares i en speciel væske og undersøges mikroskopisk for eventuelle defekter. Æg overføres til en petriskål, der indeholder frisk sæd. Gameterne tager 12-15 timer at befrugte. Efter befrugtning holdes gygote i en anden væske ved kropstemperaturen. Celledeling observeres regelmæssigt. Når embryo når til blastocyststadiet, det sidste vækststadium, implanteres det i livmoderen. Det er ikke nødvendigt, at alle de implanterede embryoner vil vokse. Der er mange komplikationer relateret til det efter implantation. For at få succes overføres der generelt tre embryoner til livmoderen ad gangen. Dette resulterer i fødsel af en, to eller tre babyer baseret på succes. Denne proces kaldes intrafallopian transfer (sift). Der er en anden teknik, hvor æg og sædceller placeres i æggeleder for at lette befrugtning. Dette er kendt som gamete intrafallopian transfer (gave).
i Indien er der ni centre som Mumbai, Kolata, Chenai, Delhi og andre, der hjælper de barnløse par.
ud over SIFT og gave anvendes mikroinjektionsteknikken også hos oligospermiske patienter. Her injiceres en sæd direkte i et æg for at lette befrugtningen.
problemer relateret til reagensglasbabyer
selvom IVF-teknologien er en velsignelse for barnløse par, er der dog flere problemer relateret til det, hvis det bliver kommercialiseret. Disse problemer kan være religiøse, etiske, følelsesmæssige eller politiske. For eksempel godkender den katolske kirke ikke IVF-teknik, da den proklamerer, at undfangelse aldrig skal tages ud af kroppen. Gaven er acceptabel, mens SIFT ikke er det. Muslimske lande som Malaysia mener, at sæddonation som umoralsk. Børn, der bæres af donerede sædceller, betragtes som illegitime. Der er dog ingen kontroverser i Indien indtil videre. I Indien blev den første sædbank oprettet i Delhi i januar 1994 for at hjælpe de barnløse par.
et af de følelsesmæssige problemer er de ubrugte ekstra embryoner. Uanset om de bliver smidt væk eller implanteret i surrogatmødre. Det første er det moralske spørgsmål. Surrogatmødrene fungerer som dyreinkubator og leverer baby efter den normale drægtighed. De bidrager ikke med de genetiske materialer, som det kommer fra donorerne. Derfor kunne surrogatmødrene kommercialiseres. Barnet vil ikke være deres rigtige. Vil de børn, der bæres gennem doneret æg/sæd, få social eller religiøs anerkendelse? Vil børnene blive kendt af deres biologiske forældre? Vil deres forældre acceptere dem?

Similar Posts

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.