Mikroinjekcja-Technika inżynierii genetycznej

author
6 minutes, 39 seconds Read

Mikroinjekcja

Mikroinjekcja jest techniką dostarczania obcego DNA do żywej komórki (komórki, jaja, oocytów, zarodków zwierząt) przez szklaną mikropipetę. Jeden koniec szklanej mikropipetki jest podgrzewany, aż szkło stanie się nieco upłynnione. Jest szybko rozciągnięty, co tworzy bardzo drobną końcówkę na rozgrzanym końcu. Końcówka pipety ma średnicę około 0,5 mm, która przypomina igłę do iniekcji. Proces dostarczania obcego DNA odbywa się pod silnym mikroskopem. Komórki do mikroiniekcji umieszcza się w pojemniku (rys. 4.15). Pipetę trzymającą umieszcza się w polu widzenia mikroskopu. Pipeta trzymająca utrzymuje komórkę docelową na końcu, gdy jest delikatnie zasysana. Końcówka mikropipety jest wstrzykiwana przez błonę komórki. Zawartość igły są dostarczane do cytoplazmy i pustą igłę wyjmuje się.

metoda mikroiniekcji przygotowania DNA w jajku

rys. 4.15. Metoda mikroinjekcji przygotowania DNA w jajku.

oocyty Xenopus były szeroko stosowane do badania transkrypcji przez mikroiniekcję, ponieważ oocyty zawierają od 6000 do 100 000 lub więcej cząsteczek polimerazy RNA niż komórki somatyczne. Mikroiniekcja jest technicznie łatwa ze względu na duże rozmiary oocytów. Niektóre z endogennych wzorców regulacji genów podczas rozwoju zostały scharakteryzowane (Wickens and Laskey, 1981). Wstrzyknięty DNA integruje się losowo z dna jądrowym, a jego ekspresja może być możliwa tylko wtedy, gdy obce DNA jest przyłączone do odpowiedniej sekwencji promotora. Istnieje wiele przykładów, w których różne typy komórek zwierzęcych zostały poddane mikroiniekcji i pomyślnie przeniesione.
Rubin i Spradling (1982) po raz pierwszy wprowadzili Gen Drosophila dla dehydrogenazy ksantynowej do pierwiastka p (element rodzicielski), który został poddany mikroiniekcji z nienaruszonym pomocniczym elementem p do zarodka z niedoborem tego genu. Takie zarodki później rozwinęły muchy o różowo zabarwionych oczach niż mozaikowe oczy, jak w pierwszym pokoleniu rodzicielskim.
Production of Transgenic Animals
In 1982, R. D. Palmiter of Washington University and R. L.Brunter z Pennsylvanian University wyizolował Gen hormonu wzrostu królika (P-globina), Gen ludzkiego hormonu wzrostu ((i-globina), a także Gen kinazy tymidynowej i połączył się oddzielnie z regionem promotora myszy związanym z genem metalotioneiny I (gen kodujący białko wiążące metal). Połączono ją z plazmidem pBR322 w celu wytworzenia rekombinowanych plazmidów. Dojrzałe jaja dorosłej myszy odzyskiwano chirurgicznie i zapłodniono nasieniem in vitro. Natychmiast zapłodnione jaja poddano mikroiniekcji rekombinowanymi plazmidami, zanim plemniki i jądra jajowe połączyły się, tworząc diploidalną zygotę. Plazmidy na ogół łączą się homologicznie ze sobą w obrębie komórki jajowej, tworząc długo powtarzające się włóknienie, które następnie integruje się losowo, dając powtarzające się geny w jednym miejscu chromosomowym. Zmodyfikowane zarodki zostały następnie wszczepione do macicy matki myszy gospodarza w celu dalszego rozwoju. Powstałe myszy nazywane są „myszami transgenicznymi”, ponieważ część genomu pochodzi od innego genetycznie niezwiązanego organizmu. Ze względu na wprowadzenie obcego genu przed fuzją jądrową, integracja chromosomów odbywa się wcześnie, a potomstwo zawiera nowe geny. Wielkość i masa ciała potomstwa były niezwykle większe od normalnych (rys. 4.16).

w innym eksperymencie ( Palmiter i wsp.1982) wstrzyknięto embrionom myszy fragment DNA zawierający Gen hormonu wzrostu szczura połączony z regionem promotora genu metalotioneiny i myszy. W tym eksperymencie wykorzystano liniowe fragmenty DNA, a nie plazmidy, ponieważ efektywniej integrują się one z chromosomami myszy. W rezultacie wyprodukowano 21 myszy, wśród nich siedem zawierało Gen fuzyjny. Sześć z nich miało dwukrotnie większą masę ciała niż pozostałe. Poziom hormonów wzrostu wzrósł wielokrotnie (między 200-800 razy) więcej niż kontrola. Ponadto zwiększono również poziom hormonu wzrostu mRNA w komórkach wątroby. Podobnie wiele zwierząt transgenicznych, takich jak owce, kozy, świnie, króliki itp. zostały również wyprodukowane za pomocą techniki mikroiniekcji.
technologia zapłodnienia in vitro (IVF)
termin in vitro oznacza w szkle lub w sztucznym stanie, a IVF odnosi się do faktu, że zapłodnienie komórki jajowej przez plemniki występuje w wyrobach szklanych.

produkcja myszy transgenicznych; MT, metionina

rys. 4.16. Produkcja myszy transgenicznych; MT, metionina.

technologia IVF u zwierząt gospodarskich
obecnie egzogenne hormony zostały opracowane dzięki technologii naturalnej i rekombinacji DNA, które są stosowane do indukowania superowulacji u zwierząt gospodarskich. Superowulacja to zjawisko polegające na wytwarzaniu większej niż normalna liczby jaj w wyniku leczenia hormonalnego przez pojedynczą samicę naraz.
normalna krowa produkuje jedno lub dwa jaja w okresie owulacji, podczas gdy ta sama może wyprodukować 8-10 jaj, gdy zostanie poddana superowulacji. Dlatego poprzez normalną reprodukcję zwierzę produkuje około 4-5 potomstwa w swoim życiu, podczas gdy dzięki technologii IVF to samo może wyprodukować 50-80 potomstwa w swoim życiu. Szczegółowy opis patrz manipulacja reprodukcją i zwierzęta transgeniczne.
technologia IVF u ludzi
technologia IVF była pionierem w ludziach przez prof. Roberta Winstona. Tę samą technikę zastosowali P. Steptoe i R. Edwards, aby 25 lipca 1978 roku wyprodukować pierwszą na świecie kobietę z probówki, Louise J. Brown. Od tego czasu wyprodukowano ponad 25 000 dzieci.
wcześniej jaja były odzyskiwane z jajnika pacjenta za pomocą laparoskopu. Małe nacięcie wykonuje się tuż poniżej pępka i wprowadza się laparoskop. Jaja są usuwane za pomocą wydrążonej igły. Ogólnie rzecz biorąc, tylko jedno jajko może być pozyskane w czasie po pewnym czasie w sposób naturalny. Ale dzięki superowulacji można uzyskać więcej jaj na raz.
hormon wstrzykuje się codziennie przez około 28 dni. Czasami mogą wystąpić działania niepożądane. Jaja są przechowywane w specjalnym płynie i badane mikroskopowo pod kątem jakichkolwiek defektów. Jaja są przenoszone do szalki Petriego zawierającej świeże nasienie. Gamety potrzebują 12-15 godzin na zapłodnienie. Po zapłodnieniu zygota jest przechowywana w innym płynie w temperaturze ciała. Podział komórek obserwuje się regularnie. Gdy zarodek osiąga stadium blastocysty, ostatni etap wzrostu, jest wszczepiany do macicy. Nie jest konieczne, aby wszystkie wszczepione embriony rosły. Istnieje wiele powikłań związanych z nim po implantacji. Dlatego, aby osiągnąć sukces, na ogół trzy zarodki są przenoszone do macicy na raz. Powoduje to narodziny jednego, dwóch lub trzech dzieci w oparciu o sukces. Proces ten nazywany jest transferem śródfalopijnym zygoty (ZIFT). Istnieje inna technika, w której jaja i plemniki są umieszczane w jajowodzie, aby ułatwić zapłodnienie. Jest to znane jako gamete intrafal transfer (GIFT).
w Indiach jest dziewięć ośrodków, takich jak Bombaj, Kolata, Chenai, Delhi i inne, pomagających parom bezdzietnym.
oprócz ZIFT i GIFT, technika mikroiniekcji jest również stosowana u pacjentów oligospermicznych. Tutaj jeden plemnik jest bezpośrednio wstrzykiwany do jaja, aby ułatwić zapłodnienie.
problemy związane z dziećmi w probówkach
chociaż technologia IVF jest dobrodziejstwem dla par bezdzietnych,ale istnieje kilka problemów związanych z nią, jeśli zostanie skomercjalizowana. Problemy te mogą mieć charakter religijny, etyczny, emocjonalny lub polityczny. Na przykład Kościół katolicki nie akceptuje techniki in vitro, ponieważ głosi, że poczęcie nigdy nie powinno być wyjęte z ciała. Prezent jest akceptowalny, a ZIFT nie. Kraje muzułmańskie, takie jak Malezja, uważają dawstwo spermy za niemoralne. Dzieci zrodzone z ofiarowanej spermy są uważane za nieślubne. W Indiach nie ma jednak do tej pory żadnych kontrowersji. W Indiach pierwszy bank spermy został założony w New Delhi w styczniu 1994 roku, aby pomóc bezdzietnym parom.
jednym z problemów emocjonalnych są niewykorzystane dodatkowe embriony. Czy zostaną wyrzucone, czy wszczepione matkom zastępczym. Pierwszym z nich jest pytanie moralne. Matki zastępcze działają jako inkubator zwierząt i rodzą dziecko po normalnej ciąży. Nie dostarczają materiałów genetycznych, ponieważ pochodzą od dawców. Dlatego matki zastępcze mogą zostać skomercjalizowane. Dziecko nie będzie ich prawdziwym. Czy dzieci urodzone przez ofiarowane jajko / spermę będą uznawane społecznie lub religijnie? Czy dzieci będą znane swoim biologicznym rodzicom? Czy rodzice je przyjmą?

Similar Posts

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.