Microinjeção-técnica de engenharia genética

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microinjeção

microinjeção é uma técnica de entrega de DNA estranho em uma célula viva (uma célula, ovo, oócito, embriões de animais) através de uma micropipeta de vidro. Uma extremidade de uma micropipeta de vidro é aquecida até que o vidro se torne um pouco liquefeito. É rapidamente esticado, o que forma uma ponta muito fina na extremidade aquecida. A ponta da pipeta atinge cerca de 0,5 mm de diâmetro, o que se assemelha a uma agulha de injeção. O processo de entrega de DNA estranho é feito sob um poderoso microscópio. As células a serem microinjectadas são colocadas em um recipiente (Fig. 4.15). Uma pipeta de retenção é colocada no campo de visão do microscópio. A pipeta de retenção mantém uma célula alvo na ponta quando sugada suavemente. A ponta da micropipeta é injetada através da membrana da célula. O conteúdo da agulha é entregue no citoplasma e a agulha vazia é retirada.

um método de microinjeção de preparação de DNA em ovo

Fig. 4.15. Um método de microinjeção de preparação de DNA em ovo. Os oócitos Xenopus têm sido amplamente utilizados para o estudo da transcrição por microinjeção porque os oócitos contêm entre 6.000 e 100.000 ou mais moléculas de RNA polimerase do que células somáticas. A microinjeção é tecnicamente fácil devido ao grande tamanho de oócitos. Alguns dos padrões endógenos de regulação gênica durante o desenvolvimento foram caracterizados (Wickens e Laskey, 1981). O DNA injetado se integra aleatoriamente ao DNA nuclear e sua expressão só pode ser possível quando o DNA estranho é anexado a uma sequência Promotora adequada. Existem muitos exemplos em que diferentes tipos de células animais foram microinjectados e transferidos com sucesso.Rubin and Spradling (1982) pela primeira vez introduziu o gene Drosophila para a xantina desidrogenase em um elemento P (elemento parental) que foi microinjectado com um elemento p auxiliar intacto em embrião deficiente para este gene. Esses embriões mais tarde desenvolveram moscas com olhos de cor rosada do que Olhos de mosaico como na primeira geração dos pais.
Produção de Animais Transgênicos
Em 1982, R. D. Palmiter da Universidade de Washington e R. L.Brinter da Universidade da Pensilvânia isolou o gene do hormônio do crescimento do coelho (p-globina), o gene do hormônio do crescimento humano ((I-globina), bem como o gene da timidina quinase e ligado separadamente à região promotora do camundongo associada ao gene metalotioneína i (um gene que codifica uma proteína de ligação metálica). Isto foi unido ao plasmídeo pBR322 para produzir os plasmídeos recombinantes. Ovos maduros de camundongos adultos foram recuperados cirurgicamente e fertilizados com espermatozóides in vitro. Imediatamente os óvulos fertilizados foram microinjectados com plasmídeos recombinantes antes que os núcleos de espermatozóides e óvulos se fundissem para formar um zigoto diplóide. Os plasmídeos geralmente se combinam homologamente entre si dentro do ovo, formando um concatemer longo e repetido que se integra aleatoriamente para fornecer genes repetidos em um único local cromossômico. Os embriões projetados foram então implantados no útero de uma mãe hospedeira para um maior desenvolvimento. Os ratos resultantes são chamados de “camundongos transgênicos”, uma vez que parte do genoma vem de outro organismo geneticamente não relacionado. Devido à introdução de gene estranho antes da fusão nuclear, a integração cromossômica ocorre cedo e a progênie contém novos genes. O tamanho e o peso corporal das progênies eram extremamente maiores do que os normais (Fig. 4.16).
em outro experimento ( Palmiter et al 1982) injetou embriões de camundongo com um fragmento de DNA contendo o gene do hormônio do crescimento do rato fundido à região promotora do gene metalotioneína I do camundongo. Neste experimento, fragmentos de DNA lineares foram usados em vez de plasmídeos porque se integram de forma mais eficiente aos cromossomos do camundongo. Consequentemente, 21 camundongos foram produzidos, entre eles sete continham o gene da fusão. Seis eram duas vezes maiores em peso corporal do que os outros. O nível de hormônios de crescimento aumentou muitas vezes (entre 200-800 vezes) mais do que o controle. Além disso, o nível de mRNA do hormônio do crescimento também foi aumentado nas células do fígado. Da mesma forma, muitos animais transgênicos, como ovelhas, cabras, porcos, coelhos, etc. também foram produzidos através da técnica de microinjeção.
tecnologia de fertilização in vitro (FIV)
o termo in vitro significa em vidro ou em condições artificiais, e a FIV refere-se ao fato de que a fertilização do óvulo pelo esperma ocorre em produtos vidreiros.

produção de camundongos transgênicos; MT, metionina

Fig. 4.16. Produção de camundongos transgênicos; MT, metionina.

tecnologia de fertilização in vitro em animais de fazenda
hoje em dia, hormônios exógenos foram desenvolvidos por meio de tecnologia de DNA Natural e recombinante que são usados para induzir superovulação em animais de fazenda. A superovulação é um fenômeno de produção maior do que o número normal de óvulos por meio de tratamento hormonal por uma única fêmea de cada vez.Uma vaca normal produz um ou dois ovos durante um período ovulatório, enquanto o mesmo pode produzir 8-10 ovos quando submetido a superovulação. Portanto, através da reprodução normal, um animal produz cerca de 4-5 descendentes em sua vida, enquanto através da tecnologia de fertilização in vitro o mesmo pode produzir 50-80 descendentes em sua vida. Para uma descrição detalhada, consulte manipulação de reprodução e animais transgênicos.
a tecnologia de fertilização in vitro em humanos
a tecnologia de fertilização in vitro foi pioneira em humanos pelo Prof. Robert Winston. A mesma técnica foi usada por P. Steptoe e R. Edwards para produzir o primeiro bebê fêmea do tubo de ensaio do mundo, Louise J. Brown, em 25 de julho de 1978. Desde então, mais de 25.000 bebês foram produzidos até agora.
os óvulos anteriores foram recuperados do ovário da paciente usando laparoscópio. Uma pequena incisão é feita logo abaixo do umbigo e o laparoscópio é introduzido. Os ovos são removidos com uma agulha oca. Geralmente, apenas um único ovo pode ser adquirido de cada vez após determinado período de maneira natural. Mas através da superovulação, mais ovos podem ser obtidos de cada vez.
o hormônio é injetado diariamente por cerca de 28 dias. Às vezes, podem ocorrer efeitos colaterais. Os ovos são mantidos em um fluido especial e examinados microscopicamente para quaisquer defeitos. Os ovos são transferidos para uma placa de Petri contendo sêmen fresco. Os gametas levam de 12 a 15 horas para fertilizar. Após a fertilização, o zigoto é mantido em outro fluido à temperatura corporal. A divisão celular é observada regularmente. Quando o embrião atinge o estágio de blastocisto, o último estágio de crescimento, é implantado no útero. Não é necessário que todos os embriões implantados cresçam. Existem muitas complicações relacionadas a ele após a implantação. Portanto, para obter sucesso, geralmente três embriões são transferidos para o útero de cada vez. Isso resulta no nascimento de um, dois ou três bebês com base no sucesso. Esse processo é chamado de transferência intrafalópica do zigoto (Zift). Existe outra técnica em que óvulos e espermatozóides são colocados na trompa de Falópio para facilitar a fertilização. Isso é conhecido como transferência intrafalópica de gameta (presente).Na Índia, existem nove centros como Mumbai, Calcutá, Chenai, Delhi e outros que ajudam os casais sem filhos.
além de ZIFT e GIFT, a técnica de microinjeção também é aplicada em pacientes oligospérmicos. Aqui, um espermatozóide é injetado diretamente em um óvulo para facilitar a fertilização.
problemas relacionados a bebês de tubo de ensaio
embora a tecnologia de fertilização in vitro seja uma benção para casais sem filhos, ainda existem vários problemas relacionados a ela, se for comercializada. Esses problemas podem ser religiosos, éticos, emocionais ou políticos. Por exemplo, a Igreja Católica não aprova a técnica de fertilização in vitro, pois proclama que a concepção nunca deve ser retirada do corpo. O presente é aceitável, enquanto ZIFT não é. Países muçulmanos como a Malásia acreditam que a doação de esperma é imoral. As crianças nascidas de espermatozóides doados são consideradas ilegítimas. No entanto, não há controvérsia na Índia até agora. Na Índia, o primeiro banco de esperma foi criado em Nova Delhi em janeiro de 1994 para ajudar os casais sem filhos.Um dos problemas emocionais são os embriões extras não utilizados. Se eles serão jogados fora ou implantados em mães de aluguel. A primeira é a questão moral. As mães substitutas atuam como Incubadoras de animais e dão à luz após a gestação normal. Eles não contribuem com os materiais genéticos, pois vêm dos doadores. Portanto, as mães de aluguel poderiam ser comercializadas. A criança não será sua verdadeira. As crianças nascidas através de óvulos/espermatozóides doados receberão reconhecimento social ou religioso? As crianças serão conhecidas de seus pais biológicos? Seus pais vão aceitá-los?

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