Microinjecție – tehnica de inginerie genetică

author
7 minutes, 24 seconds Read

microinjecție

microinjecția este o tehnică de livrare a ADN-ului străin într-o celulă vie (o celulă, ou, ovocit, embrioni de animale) printr-o micropipetă de sticlă. Un capăt al unei micropipete de sticlă este încălzit până când sticla devine oarecum lichidată. Se întinde rapid, ceea ce formează un vârf foarte fin la capătul încălzit. Vârful pipetei atinge un diametru de aproximativ 0,5 mm, care seamănă cu un ac pentru injecție. Procesul de livrare a ADN-ului străin se face sub un microscop puternic. Celulele care trebuie microinjectate sunt plasate într-un recipient (Fig. 4.15). O pipetă de susținere este plasată în câmpul vizual al microscopului. Pipeta de susținere ține o celulă țintă la vârf atunci când este aspirată ușor. Vârful micropipetei este injectat prin membrana celulei. Conținutul acului este livrat în citoplasmă și acul gol este scos.

o metodă de microinjecție a preparatului ADN în ou

Fig. 4.15. O metodă de microinjecție a preparării ADN-ului în ou.

ovocitele Xenopus au fost utilizate pe scară largă pentru studiul transcripției prin microinjecție, deoarece ovocitele conțin între 6.000 și 100.000 sau mai multe molecule de ARN polimerază decât celulele somatice. Microinjecția este ușoară din punct de vedere tehnic datorită dimensiunii mari a ovocitelor. Unele dintre modelele endogene de reglare a genelor în timpul dezvoltării au fost caracterizate (Wickens și Laskey, 1981). ADN-ul injectat se integrează aleatoriu cu ADN-ul nuclear și expresia sa ar putea fi posibilă numai atunci când ADN-ul străin este atașat la o secvență promotor adecvată. Există multe exemple în care diferite tipuri de celule animale au fost microinjectate și transferate cu succes.
Rubin și Spradling (1982) au introdus pentru prima dată gena Drosophila pentru xantin dehidrogenază într-un element P (element parental) care a fost microinjectat cu un element p ajutor intact în embrion deficitar pentru această genă. Astfel de embrioni au dezvoltat mai târziu muște cu ochi de culoare roz decât ochii mozaici ca în prima generație parentală.
producția de animale transgenice
în 1982, R. D. Palmiter de la Universitatea Washington și R. L.Brinter de la Universitatea Pennsylvania a izolat gena hormonului de creștere a iepurelui (p-globină), gena hormonului de creștere uman ((i-globină), precum și gena timidin kinazei și legată separat de regiunea promotor a șoarecelui asociată cu gena metalotioneinei I (o genă care codifică o proteină de legare a metalului). Aceasta a fost asociată cu plasmida pBR322 pentru a produce plasmidele recombinante. Ouăle Mature de la șoarecii adulți au fost recuperate chirurgical și fertilizate cu spermatozoizi in vitro. Imediat ovulele fertilizate au fost microinjectate cu plasmide recombinante înainte ca nucleele spermatozoizilor și ovulelor să se fi contopit pentru a forma un zigot diploid. Plasmidele se combină în general omolog între ele în interiorul oului formând un concatemer repetat lung, care apoi se integrează aleatoriu pentru a da gene repetate la un singur loc cromozomial. Embrionii proiectați au fost apoi implantați în uterul unei mame de șoarece gazdă pentru o dezvoltare ulterioară. Șoarecii rezultați sunt numiți șoareci transgenici, deoarece o parte a genomului provine dintr-un alt organism fără legătură genetică. Datorită introducerii genei străine înainte de fuziunea nucleară, integrarea cromozomială are loc devreme, iar descendenții conțin gene noi. Mărimea și greutatea corporală a progeniturilor au fost extrem de mari decât cele normale (Fig. 4.16).

într-un alt experiment ( Palmiter et al 1982) a injectat embrioni de șoarece cu un fragment de ADN care conține gena hormonului de creștere de șobolan fuzionată cu regiunea promotor a genei metalotioneinei i de șoarece. În acest experiment, fragmentele ADN liniare au fost utilizate mai degrabă decât plasmidele, deoarece acestea se integrează mai eficient în cromozomii de șoarece. În consecință, au fost produși 21 de șoareci, dintre care șapte conțineau gena de fuziune. Șase au fost de două ori mai mari în greutate corporală decât celelalte. Nivelul hormonilor de creștere a crescut de mai multe ori (între 200-800 de ori) mai mult decât controlul. În plus, nivelul ARNm al hormonului de creștere a fost, de asemenea, crescut în celulele hepatice. În mod similar, multe animale transgenice, cum ar fi oile, caprele, porcii, iepurele etc. au fost, de asemenea, produse prin tehnica microinjecției.
tehnologia de fertilizare in vitro (FIV)
termenul in vitro înseamnă în sticlă sau în stare artificială, iar FIV se referă la faptul că fertilizarea ovulului prin spermă are loc în sticlă.

producția de șoareci transgenici; MT, metionină

Fig. 4.16. Producția de șoareci transgenici; MT, metionină.

tehnologia FIV la animalele de fermă
în prezent, hormonii exogeni au fost dezvoltați prin tehnologia ADN-ului natural și recombinant, care sunt utilizați pentru a induce superovulația la animalele de fermă. Superovulația este un fenomen de producere mai mare decât numărul normal de ouă prin tratament hormonal de către o singură femelă la un moment dat.
o vacă normală produce unul sau două ouă în timpul unei perioade ovulatorii, în timp ce aceeași poate produce 8-10 ouă atunci când este supusă superovulației. Prin urmare, prin reproducere normală, un animal produce aproximativ 4-5 descendenți în viața ei, în timp ce prin tehnologia FIV același lucru poate produce 50-80 de descendenți în viața ei. Pentru o descriere detaliată, consultați manipularea reproducerii și a animalelor transgenice.
tehnologia FIV la om
tehnologia FIV a fost pionierată la om de către Prof.Robert Winston. Aceeași tehnică a fost folosită de P. Steptoe și R. Edwards pentru a produce primul copil de sex feminin din lume, Louise J. Brown, la 25 iulie 1978. De atunci, peste 25.000 de copii au fost produși până acum.
ovulele anterioare au fost recuperate din ovarul pacientului prin utilizarea laparoscopului. O mică incizie se face chiar sub ombilic și se introduce laparoscopul. Ouăle sunt îndepărtate cu un ac gol. În general, numai un singur ou poate fi achiziționat la un moment dat după o anumită perioadă în mod natural. Dar prin superovulație se pot obține mai multe ouă la un moment dat.

hormonul este injectat zilnic timp de aproximativ 28 de zile. Uneori pot apărea reacții adverse. Ouăle sunt păstrate într-un fluid special și examinate microscopic pentru orice defecte. Ouăle sunt transferate într-un vas Petri care conține material seminal proaspăt. Gameții au nevoie de 12-15 ore pentru a se fertiliza. După fertilizare, zigotul este păstrat într-un alt fluid la temperatura corpului. Diviziunea celulară este observată în mod regulat. Când embrionul ajunge la stadiul de blastocist, ultima etapă de creștere, este implantat în uter. Nu este necesar ca toți embrionii implantați să crească. Există multe complicații legate de aceasta după implantare. Prin urmare, pentru a obține succes, în general, trei embrioni sunt transferați în uter la un moment dat. Acest lucru duce la nașterea unuia, a doi sau a trei bebeluși pe baza succesului. Acest proces se numește transfer intrafallopian zigot (ZIFT). Există o altă tehnică în care ouăle și spermatozoizii sunt plasați în trompa uterină pentru a facilita fertilizarea. Acest lucru este cunoscut sub numele de transfer intrafallopian gamete (cadou).
în India, există nouă centre precum Mumbai, Kolata, Chenai, Delhi și altele care asistă cuplurile fără copii.
pe lângă ZIFT și cadou, tehnica microinjecției este aplicată și la pacienții oligospermici. Aici, un spermatozoid este injectat direct într-un ovul pentru a facilita fertilizarea.
probleme legate de bebelușii cu eprubetă
deși tehnologia FIV este un avantaj pentru cuplurile fără copii, totuși există mai multe probleme legate de aceasta, dacă devine comercializată. Aceste probleme pot fi religioase, etice, emoționale sau politice. De exemplu, Biserica Catolică nu aprobă tehnica FIV, deoarece proclamă că concepția nu trebuie scoasă niciodată din corp. Darul este acceptabil, în timp ce ZIFT nu este. Țări musulmane precum Malaezia consideră că donarea de spermă este imorală. Copiii născuți din spermatozoizi donați sunt considerați ilegitimi. Cu toate acestea, nu există controverse în India până acum. În India, prima bancă de spermă a fost înființată în New Delhi în ianuarie 1994 pentru a ajuta cuplurile fără copii.
una dintre problemele emoționale este embrionii suplimentari neutilizați. Fie că vor fi aruncate sau implantate în mame surogat. Prima este întrebarea morală. Mamele surogat acționează ca incubator de animale și să livreze copilul după gestație normală. Ei nu contribuie cu materialele genetice, deoarece provin de la donatori. Prin urmare, mamele surogat ar putea fi comercializate. Copilul nu va fi cel real. Copiilor născuți prin donarea de ovule/spermă li se va acorda recunoaștere socială sau religioasă? Copiii vor fi cunoscuți de părinții lor biologici? Părinții lor îi vor accepta?

Similar Posts

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.