Mikroinjektion-genteknik

author
6 minutes, 38 seconds Read

mikroinjektion

mikroinjektion är en teknik för att leverera främmande DNA till en levande cell (en cell, ägg, oocyt, embryon av djur) genom en glasmikropipett. Ena änden av en glasmikropipett upphettas tills glaset blir något flytande. Det sträcker sig snabbt vilket bildar en mycket fin spets vid den uppvärmda änden. Pipettspetsen når en diameter på ca 0,5 mm som liknar en injektionsnål. Processen att leverera främmande DNA görs under ett kraftfullt mikroskop. Celler som ska mikroinjiceras placeras i en behållare (Fig. 4.15). En hållpipett placeras i mikroskopets synfält. Hållpipetten håller en målcell vid spetsen när den sugs försiktigt. Spetsen på mikropipetten injiceras genom cellens membran. Innehållet i nålen levereras in i cytoplasman och den tomma nålen tas ut.

 en metod för mikroinjektion av DNA-beredning i ägg

Fig. 4.15. En metod för mikroinjektion av DNA-beredning i ägg.

Xenopus oocyter har använts i stor utsträckning för studier av transkription genom mikroinjektion eftersom oocyter innehåller mellan 6 000 och 100 000 eller fler RNA-polymerasmolekyler än somatiska celler. Mikroinjektion är tekniskt lätt på grund av stor storlek av oocyter. Några av det endogena mönstret för genreglering under utveckling har karakteriserats (Wickens och Laskey, 1981). Det injicerade DNA integreras slumpmässigt med kärn-DNA och dess uttryck kan endast vara möjligt när det främmande DNA är fäst vid en lämplig promotorsekvens. Det finns många exempel där olika typer av djurceller har mikroinjekterats och framgångsrikt överförts.
Rubin och Spradling (1982) introducerade för första gången Drosophila-gen för xantindehydrogenas i ett P-element (föräldraelement) som mikroinjekterades med ett intakt hjälpreda P-element i embryobrist för denna gen. Sådana embryon utvecklade senare flugor med rosiga ögon än mosaikögon som i den första föräldragenerationen.
produktion av transgena djur
1982, R. D. Palmiter Från Washington University och R. L.Brinter från Pennsylvanian University isolerade kanintillväxthormonet (p-globin) – genen, humant tillväxthormon ((i-globin) – genen samt tymidinkinasgenen och länkades separat till promotorregionen av mus associerad med metallothionein i-genen (en gen som kodar för ett metallbindande protein). Detta förenades med pBR322-plasmid för att producera rekombinanta plasmider. Mogna ägg från vuxen mus återvanns kirurgiskt och befruktades med spermier in vitro. Omedelbart mikroinjicerades de befruktade äggen med rekombinanta plasmider innan spermierna och äggkärnorna har smält samman för att bilda en diploid zygot. Plasmiderna kombinerar i allmänhet homologt med varandra i ägget och bildar en lång upprepad konkateter som sedan integreras slumpmässigt för att ge upprepade gener på ett enda kromosomalt ställe. De konstruerade embryona implanterades sedan i livmodern hos en värdmusmamma för vidare utveckling. De resulterande mössen kallas ’transgena möss’ eftersom en del av genomet kommer från en annan genetiskt orelaterad organism. På grund av införandet av främmande gen före kärnfusion sker kromosomal integration tidigt och avkomma innehåller nya gener. Avkommans storlek och kroppsvikt var extremt större än de normala (Fig. 4.16).

i ett annat experiment ( Palmiter et al 1982) injicerade musembryon med ett DNA-fragment innehållande råtttillväxthormongenen smält till promotorområdet för musmetallothionein i-genen. I detta experiment användes linjära DNA-fragment snarare än plasmider eftersom dessa integreras mer effektivt i muskromosomerna. Följaktligen producerades 21 möss, bland dem innehöll sju fusionsgenen. Sex var två gånger större i kroppsvikt än de andra. Nivån av tillväxthormoner ökade många gånger (mellan 200-800 gånger) mer än kontrollen. Dessutom ökade nivån av tillväxthormon mRNA också i leverceller. På samma sätt många transgena djur som får, get, grisar, kanin etc. har också producerats genom mikroinjektionsteknik.
in vitro fertilization (IVF) – teknik
termen in vitro betyder i glas eller i artificiellt tillstånd, och IVF hänvisar till det faktum att befruktning av ägg med spermier sker i glasvaror.

produktion av transgena möss; MT, metionin

Fig. 4.16. Produktion av transgena möss; MT, metionin.

IVF-teknik hos husdjur
numera har exogena hormoner utvecklats genom naturligt och rekombinant DNA-teknik som används för att inducera superovulation hos husdjur. Superovulation är ett fenomen att producera större än det normala antalet ägg genom hormonell behandling av en enda kvinna i taget.
en normal ko producerar ett eller två ägg under en ägglossningsperiod, medan samma kan producera 8-10 ägg när de utsätts för superovulation. Därför producerar ett djur genom normal reproduktion cirka 4-5 avkommor i sitt liv, medan genom IVF-teknik kan samma producera 50-80 avkommor i hennes liv. För en detaljerad beskrivning se Manipulation av reproduktion och transgena djur.
IVF-teknik hos människor
IVF-teknik var banbrytande hos människor av Prof. Robert Winston. Samma teknik användes av P. Steptoe och R. Edwards för att producera världens första provrörsbarn, Louise J. Brown, den 25 juli 1978. Sedan dess har mer än 25 000 barn producerats hittills.
tidigare ägg återhämtades från patientens äggstock med hjälp av laparoskop. Ett litet snitt görs strax under naveln och laparoskopet introduceras. Ägg avlägsnas med en ihålig nål. I allmänhet kan endast ett enda ägg anskaffas vid en tidpunkt efter en viss period på naturligt sätt. Men genom superovulation kan fler ägg erhållas åt gången.
hormonet injiceras dagligen i cirka 28 dagar. Ibland kan biverkningar äga rum. Äggen hålls i en speciell vätska och undersöks mikroskopiskt för eventuella defekter. Ägg överförs till en petriskål som innehåller färsk sperma. Könscellerna tar 12-15 timmar att befrukta. Efter befruktning hålls zygot i en annan vätska vid kroppstemperaturen. Celldelning observeras regelbundet. När embryot når blastocyststadiet, det sista tillväxtstadiet, implanteras det i livmodern. Det är inte nödvändigt att alla implanterade embryon kommer att växa. Det finns många komplikationer relaterade till det efter implantation. För att få framgång överförs i allmänhet tre embryon i livmodern åt gången. Detta resulterar i födelse av en, två eller tre barn baserat på framgång. Denna process kallas zygote intrafallopian transfer (ZIFT). Det finns en annan teknik där ägg och spermier placeras i äggledaren för att underlätta befruktning. Detta är känt som gamete intrafallopian transfer (gåva).
i Indien finns det nio centra som Mumbai, Kolata, Chenai, Delhi och andra som hjälper de barnlösa paren.
förutom ZIFT och GIFT tillämpas mikroinjektionstekniken också hos oligospermiska patienter. Här injiceras en sperma direkt i ett ägg för att underlätta befruktningen.
problem relaterade till provrörsbarn
även om IVF-tekniken är en välsignelse för barnlösa par, men det finns flera problem relaterade till det, om det blir kommersialiserat. Dessa problem kan vara religiösa, etiska, emotionella eller politiska. Till exempel godkänner den katolska kyrkan inte IVF-teknik eftersom den förkunnar att uppfattningen aldrig ska tas ut ur kroppen. Gåvan är acceptabel, medan ZIFT inte är det. Muslimska länder som Malaysia tror att spermadonationen är omoralisk. Barn som bärs av donerade spermier anses vara olagliga. Det finns dock ingen kontrovers i Indien hittills. I Indien inrättades den första spermabanken i New Delhi i januari 1994 för att hjälpa de barnlösa paren.
ett av de känslomässiga problemen är de oanvända extra embryona. Oavsett om de kommer att kastas eller implanteras i surrogatmödrar. Den första är den moraliska frågan. Surrogatmödrarna fungerar som djurinkubator och levererar barn efter den normala graviditeten. De bidrar inte med det genetiska materialet som det kommer från givarna. Därför kan surrogatmödrarna kommersialiseras. Barnet kommer inte att vara deras riktiga. Kommer barnen som bärs genom donerade ägg / spermier att få socialt eller religiöst erkännande? Kommer barnen att känna till sina biologiska föräldrar? Kommer deras föräldrar att acceptera dem?

Similar Posts

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.